紅球藻-astaxanthin

 

 

                                                                      

 

 

 

 

 

 

 

養 殖 研 究 所

林舒美

 

前言

Astaxanthin屬於β-胡蘿蔔素的一種，是生物界中分佈最廣泛的一種葉黃素類色素，存在於水産動物的蝦、蟹、魚和鳥類的羽毛中，呈橙紅色 (Johnson and An, 1991)。它與維生素一樣，動物不能自行合成，但有些甲殼類可將類胡蘿蔔素轉化為astaxanthin，可是仍無法達到體內需求量，所以還是必須從食物中攝取。

各種動物體內的astaxanthin所積貯的量各不相同，動物中各組織之間所貯存的astaxanthin的形式也不相同。以野生的水生動物為對象所得之研究結果說明，astaxanthin在水生動物體內的存在形式有脂化和游離兩種。其中水生動物的皮膚和外殼上的astaxanthin以脂化形式存在爲主；內臟及血液等，則以游離形式存在爲主，如下表所示：

水生動物astaxanthin的存在形式和含量（mg/kg）

 

現今發現到有些微藻、菌類等微生物能自體合成astaxanthin (Andrewes et al., 1976; Grung et al., 1992; Yokoyama et al., 1994)，當這些微生物被魚、蝦或介蟲之類攝食後，astaxanthin開始進入食物鏈，被食物鏈上的各種動物攝取及累積。  

Astaxanthin是極具潛力的一種類胡蘿蔔素，其天然來源包括甲殼類動物 (蝦、蟹)、綠色微藻以及一種酵母Phaffia rhodozyma。然而，甲殼類動物和Phaffia rhodozyma所含的astaxanthin濃度甚低，而綠藻中的單細胞藻－雨生紅球藻所含有的astaxanthin則高出數倍，因此成為商業化生產的理想選擇 (Johnson and An, 1991, Nelis and De Leenheer, 1991)。

Astaxanthin在水產界又稱之為蝦紅素，其化學名稱爲3,3`-dihydroxy-β,β-carotene-4,4`-dinoe，分子式C₄₀H₅₂O₄。具有水溶性和親脂性，易溶於二硫化碳、丙酮、苯和氯仿等有機溶劑。

 

Astaxanthin及其異構物的結構如下： 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Astaxanthin最重要的特性在於它的抗氧化性。醣類、脂質和蛋白質等有機物在體內經過一系列的氧化分解，最終都將生成二氧化碳和水而釋放出能量，此稱為氧化作用。在正常情況下，體內的氧化反應都受到調節和控制；但當有自由基産生時，就會發生過氧化反應。自由基是具有未配對電子的原子或原子團，有超氧化物陰離子自由基（O₂^-）、羥自由基（OH^-）、氫自由基（H⁺）和甲基自由基（CH₃^-）等。自由基非常活潑，反應性極強，能觸發鏈式反應而致生物膜上的脂質過氧化，從而破壞膜的結構與功能。它能引起蛋白質變性並使酵素及激素失去活性，導致生體的免疫能力降低，甚至破壞核酸的結構而導致代謝異常等等。此時astaxanthin即可發揮功用，中和這些自由基達成保護人體健康之目的。也就是在astaxanthin的分子結構中，有很長的共軛雙鍵，有羥基和在共軛雙鍵鏈末端的不飽和酮，其中羥基和酮基又構成α—羥基酮。這些結構都具有比較活潑的電子效應，能提供自由基電子或吸引自由基的未配對電子。由此可見，astaxanthin的結構特點非常容易與自由基反應，進而清除自由基，達到抗氧化作用。

Astaxanthin 的 功 用 及 其 應 用

(一) 人類藥品
1、抗氧化劑：astaxanthin的抗氧化作用遠勝維他命C、維他命E、胡蘿蔔素、

葉黃素、玉米黃質和角黃素。Miki（1991）以含亞鐵離子的血紅素蛋白作爲自由基供體，亞油酸爲受體，用硫代巴比妥酸法檢測各種類胡蘿蔔素。結果證實astaxanthin抗氧化能力比β－胡蘿蔔素高10倍，比維生素E高500-1000倍。也因如此，所以又稱之為「超級維他命E」。

2、調節免疫，預防化學致癌。

3、增加高密度脂蛋白（HDL），預防動脈硬化等相關疾病：由於血液中不飽和脂肪酸的氧化作用被抑制，使得血管壁上的沈積物減少，進而抑制動脈粥狀硬化。

4、改善視力。

5、預防神經性疾病的發生，如老年癡呆症、帕金森氏症。

6、抵禦紫外線輻射損害。

7、提高免疫力。

8、預防傳染病。

9、消炎。

10、預防不孕症。

(二) 水產飼料

1、對於養殖的水産品，astaxanthin在防治疾病方面有與對人類同樣的功用，有助於降低魚類死亡率，並提高繁殖率。對於長期困擾養殖業經營者的養殖品經常病死的問題，投餵含有astaxanthin的餌料是解決的方法之一。

2、在水產養殖業內，投餵添加astaxanthin的飼料會使得魚肉產生橙紅色澤，與這些魚類在海洋中攝食含有astaxanthin的微藻所得色調亦相同。增加其色澤、營養價值，即可提高銷售價格。

 (三) 禽畜飼料

 1、對於飼養的禽畜，astaxanthin在防治疾病方面也有功效。astaxanthin可提高

免疫力和消炎能力，使動物的活存率大為提高，降低傳染病的發生。

2、提昇家禽的産蛋率。

3、家禽會將astaxanthin富集在卵中，不僅增加蛋黃的色澤，其蛋的營養價值也大幅提高。

Astaxanthin的 生 産 與 開 發

目前可經由3種方法(水產品廢棄物、酵母菌、藻類)中萃取，而其中又以藻類最具開發性。茲詳細說明如下：

(一) 從水産加工廢棄物中提取astaxanthin

    在美國曾有報導指出，從蝦、蟹的廢棄物中提取astaxanthin可高達153 μg/g。並且發現到廢棄物中的石灰質會影響astaxanthin的産量，因此在萃取時應儘量將其除去。近年來，挪威等國採用青貯技術處理水産廢棄物，使回收率提高了10％。實驗證實出在青貯過程中加入無機酸或有機酸，會破壞astaxanthin與蛋白質或骨骼部分的結合，因而增加astaxanthin的積聚量。

從水産加工廢棄物中提取astaxanthin的主要生産過程如下：

    首先，在生産astaxanthin時，將貯存於雙層乙烯袋中、在-70℃保存的廢棄物，粉碎成膏狀物。按重量比1：1加入大豆油。攪拌均勻後，用鉛或鉑把容器圍起來避光。緩緩加熱到90℃停止，利用低溫離心技術（0℃，11000rpm/min，10min）收集油溶液，使之分層；此後astaxanthin存在於上層色素液中。用分液裝置分離、萃取，即得astaxanthin。此法生産條件要求苛刻，生産成本高，産量較低且産品純度不高，因此目前僅有少數國家應用這種技術生産astaxanthin。

(二) 利用酵母菌生産astaxanthin

    目前發現Phaffia rhodozyma (紅酵母)此種酵母能夠合成astaxanthin。Phaffia rhodozyma是70年代由Phaff等人在日本及美國阿拉斯加山區落葉樹的滲出物中首先分離到的（Phaff et al., 1972）。Phaffia rhodozyma的繁殖方式爲無性生殖。該菌發酵能産生10多種類胡蘿蔔素，主要有astaxanthin、β－胡蘿蔔素、γ－胡蘿蔔素等；其中astaxanthin佔60％－85％。Phaffia rhodozyma生産astaxanthin的最佳條件：碳源爲葡萄糖、纖維二糖；氮源爲硫酸銨，最適培養溫度爲20-22℃，最適pH值爲5.0。Phaffia rhodozyma屬於兼氣性好氧的微生物，供氧速率要高於30mmol/h，低於此值時，astaxanthin的産量明顯下降。Phaffia rhodozyma原始菌株的合成能力較低，其類胡蘿蔔素生產總量不及500 μg/g的細胞乾重，astaxanthin則爲350 μg/g的細胞乾重左右。Johnson等人在培養液中加入番茄汁（含有astaxanthin的前驅物質），astaxanthin的含量可提高到814 μg/g。而Calo等人在培養基中加入0.1％的甲羥戊酸（類胡蘿蔔素合成的起點物質），astaxanthin和總色素量增加了400％。Meyer發現添加乙酸能夠增加Phaffia rhodozyma的生物量，細胞中astaxanthin含量達到1430 μg/g細胞乾重。

    Astaxanthin為細胞內色素，在投餵動物前必須破碎細胞。爲了促進色素的釋出，Okagbue and Lewis採用蒸餾水和檸檬酸自溶法。Gentles and Haard (1991)在實驗中發現，Phaffia rhodozyma經過機械磨碎（MY）、酵素處理（EY）、噴霧乾燥（SY）以及在投餵前先萃取出類胡蘿蔔素，這四種方法均能使鱒魚呈現良好的顯色，在8周之後，魚體的顔色的深淺呈現：MY＞EY＞SY＞C＞對照組 的趨勢。由此可見，機械磨碎細胞是一種簡便而有效的方法。另有學者採用鹽酸—熱破碎細胞法，也能産生很好的效果。

(三) 從藻類中萃取astaxanthin

    根據研究報導，目前已有很多藻類能夠産生astaxanthin (Table.1)，其中以雨生紅球藻中的積聚量為最高。雨生紅球藻在分類上的位階為：綠藻門，綠藻綱，大團藻目，紅球藻科。以下則針對在不同變因、環境因子控制下，紅球藻的Astaxanthin的含量之變化。

1. 光度(light intensity)：光度對於紅球藻的生長率及astaxanthin積聚會有顯著的影響。紅球藻在低光度(50μmol photo m^-2 s^-1)下可獲得較高的生物量。而當生物量達到最高值時，氮和磷含量會急速下降，此時添加氯化鈉並且增加光度即可促進astaxanthin的合成 (Harker et al., 1996)。Lu et al.（1994）指出紅球藻生長率達到飽和的光度為90μmol photo m^-2 s^-1；而當光度在130μmol photo m^-2 s^-1以上時則會抑制生長，但相對地也會使得astaxanthin大量積聚。亦有報告顯示(Boussiba and Vonshak., 1991)光度在170μmol photo m^-2 s^-1可刺激astaxanthin的含量，會造成細胞溶解死亡。相關報告顯示出光度在90 μmol photo m^-2 s^-1情況下20天後，astaxanthin積聚量為500 pg/cell。早期研究報告顯示，用藍光照射時，也可誘導紅球藻合成類胡蘿蔔素和astaxanthin。目前已知雨生紅球藻體中astaxanthin佔其細胞中類胡蘿蔔素總量的90％以上，其含量與光的性質與強度有關。試驗證明，光的強度越高，astaxanthin的産量也越高，而且連續光照的效果比間斷光照好（Johnson et al., 1991）。

2. 營養(氮、磷)的限制因素：第二級類胡蘿蔔素的合成主要取決於環境因子，例如培養基中的營養鹽成分。研究報告顯示氮的不足可誘導astaxanthin的合成(Goodwin and Jamikon., 1954)，Kakizono et al.（1992）證實高碳氮比（C/N）可刺激類胡蘿蔔素的含量。Harker et al.（1996）說明紅球藻在氮缺乏之情況下生長率會被抑制，但是可增進astaxanthin的積聚；培養30天後類胡蘿蔔素的含量為300 pg/cell 。而Rise（1994）亦發現一種綠球藻Chlorella zofingiensis同樣地在氮缺乏下，其astaxanthin的積聚可達到最大值。而不同氮、磷的來源對於生長也有相當大的差異。目前以urea(尿素)、potassium nitrate(硝酸鉀)為最優質的氮、磷來源(Harker et al., 1995)。Borowitzka（1988）以ammonium salt作為氮來源，結果發現生物量下降，嚴重時會導致細胞死亡。以生長率而言，氮、磷最適宜的濃度為0.5-1.0g/l (Borowitzka et al., 1991)。

3. 金屬離子(metal ions)與氧化(oxidative)的刺激：添加Fe²⁺和Mn²⁺會使細胞生長停止、並造成細胞的型態及astaxanthin結構上的轉變。但最終會使紅球藻中類胡蘿蔔素的含量達20 mg/l (Kobayashi et al., 1991)。Haeker et al.（1996）在生長率方面顯示，微量的Fe²⁺對於astaxanthin的合成有刺激效果，但是濃度過高時則會抑制生長。Astaxanthin積聚量在30天後大約為500 pg/cell。其他的金屬如Mn²⁺、Cd²⁺的添加可提高類胡蘿蔔素的含量，但在生長率上則嚴重被抑制。在所有金屬的測試下，發現只有Fe²⁺在生長率方面可使得類胡蘿蔔素每單位養殖體積提昇；然而，EDTA-FeCl₃·6H₂O的加入在astaxanthin方面並無顯著的差異 (Borowitzka et al., 1991)。添加acetate(醋酸鹽)或acetate + Fe²⁺(醋酸鹽加二價鐵離子)使紅球藻的型態由營養細胞轉為胞囊細胞並促進astaxanthin的形成，而Fe²⁺的添加更能加快此型態的改變。但釋放線菌素D(actinomycin D)或放線菌酮(cycloheximide)會抑制不動藻細胞(cyst cell)及astaxanthin的形成，因此，必須在抑制物尚未存在前添加。OH⁺可經由iron-catalyzed Fenton reaction增加類胡蘿蔔素的合成，並證實四種激活氧 (singlet oxygen、superoxide anion radical、hydrogen peroxide、peroxy radical)可取代Fe²⁺，用來提高不動藻細胞(cyst cell)中類胡蘿蔔素的合成。由結果推斷：在激活氧的刺激下可影響由醋酸鹽誘導而來的不動藻細胞(acetate-induce cyst cell)中類胡蘿蔔素轉譯後的活化 (Kobayashi et al., 1993) 。

4. 添加鹽度後的變化：Borowitzka et al. (1991)指出，當palmella cell(膠集體群細胞)增加且鹽度(NaCl)大於1﹪時，會造成細胞溶解死亡。Boussiba and Vonshak(1991)亦說明紅球藻在添加0.8﹪NaCl 的環境下會導致生長完全停止並且誘使astaxanthin大量積聚。此外，Cordero et al. (1996)及Harker et al. (1995)更進一步發現25-35 mM的NaCl可刺激astaxanthin 合成，最適宜的濃度為0.2﹪。但高於2﹪時，則會降低astaxanthin的合成。在100mM NaCl及添加KCl環境下曾發現高含量的astaxanthin(500 pg/cell)，但隨之而來的是大量的死亡。近來Yong Y.E.及Qiaolan Ying. (2001)發現紅球藻對於鹽的添加僅能在弱光下誘導astaxanthin的積聚，但在強光下卻會導致不同品系間astaxanthin的含量下降。

5. 溫度與PH：紅球藻的理想生長溫度需求不高，在溫帶地區則較易發現到紅球藻。紅球藻的生長溫度範圍15-25℃，最適宜為14-15℃，而35℃以上會抑制生長，造成死亡(Borowitzka et al., 1991, Harker et al., 1995.)。Lu et al.(1994)亦指出，雨生紅球藻最適宜的溫度是24-28℃，生長率約為0.03 h^-1；而Ding and Lee（1994）也在同年間證實H. lacustris溫度範圍21-27℃，最適宜為25℃。並發現到在固定化狀態下，溫度32℃以上尚可存活，且生長率為0.011 h^-1。pH值對紅球藻的生長影響變化不大，僅發現pH 7.5時的細胞數量比pH6.5來得多。

提昇細胞生長率及astaxanthin合成：

紅球藻在培養的過程中，acetate的添加可提高生長率亦可誘導紅色膠集體群細胞(red palmella cell) 及不動孢子(aplanospores)的形成(Borowizka et al.,1991)。濃度在15mM時，紅球藻在異營培養環境下生長率為0.24 d^-1；而在mixotrophic培養則為0.58 d^-1。微量的acetate促使astaxanthin的積聚，而acetate當濃度高於0.1 g/l時則會抑制astaxanthin的累積。另外，Kobayashi et al., 1992 及Cordero et al., 1996，發現pyruvate的添加效果比acetate來得顯著。

紅球藻之固定化 (Immobilization)：

紅球藻在固定化的環境下對於溫度有相當大的耐受性。包埋在褐藻膠的狀態、溫度32℃時，尚可觀察到細胞生長(0.011 h^-1)。而未包埋的細胞此時則無法生存(Ding and Lee., 1994)；包埋於含Ca-alginate狀態的細胞因為可以受到妥善的保護，對於生長率有顯著的效果。

Astaxanthin在商業化的生產及應用：

Tsavalos et al., (1992)早期研究報告指出紅球藻astaxanthin最終乾重可達6-8﹪；但在進行商業化規模的養殖時，只能呈現出低生長率，並且在進行Two-stage培養時，紅球藻對於光照及溫度的需求不同。Two-stage意指為兩種生產階段，由最初的生物量(第一階段)轉為astaxanthin的產量(第二階段)。生物量受制於光照，其僅在弱光下才可達到高生長率。而Fábregas (2000)的報告顯示出在營養鹽充足情況下，強、弱光對於第一階段培養毫無影響。在astaxanthin產量方面，高密度的生物量及強光或者外來的刺激因子的添加(NaCl、oxygen、acetate)是必要的。但是，在室外培養的情況下，要穩定生長率及生物量仍是一項難題。主要原因為：易受污染、毒害，密度太高會導致抑制形成之反效果以及原生動物的存在。

在水產動物體內astaxanthin的含量不高，且在萃取的過程中易受到氧化而形成astatene，此種色素無任何作用。所以理想的抗氧化劑應預防astaxanthin的氧化。目前鮭鱒魚類、甲殼類、家禽的飼料中已廣泛添加astaxanthin，使得上述動物的皮膚、蛋顯現鮮明的色澤。

結語

astaxanthin原先是在蝦殼中被萃取出，而使用於飼料、醫療、配藥、化妝品上發現到有極為強大的功用，故廣泛的被利用。但由於蝦殼的來源不穩定、供不應求，若要大量產生，必須由其他相關的動植物做探測。在藻類中，發現到紅球藻可產生大量的astaxanthin，以致於這方面的研究頗受重視。紅球藻之所以會產生astaxanthin，主要是在營養受到限制、惡劣環境之情形下為求保護藻體而形成的一種葉黃素。此色素在強光或者受到迫害時，可維持細胞的型態不受到影響以及死亡；而反觀其他的藻類，則會在相同環境中分泌出膠質來保護藻體，以防止細胞溶解死亡。為求得到最大量的astaxanthin，需先使紅球藻的生物量達到最高值，此為第一階段，而後再經由環境因子的控制(光度、營養鹽)及化學物質的添加(氯化鈉、acetate)迅速地使紅球藻的型態改變，形成不動孢子(aplanospores)，進而得到大量的astaxanthin。此為第二階段。

因為astaxanthin能改善水產品、禽蛋的色澤，滿足消費者的需求，而在人體方面也具有抗氧化、增強免疫力等作用，另外，astaxanthin無毒害，且不會造成環境污染，是一種綠色添加劑，所以在未來是極具有廣闊的市場前景。目前已有許多生物技術公司致力於開發生產這類產品，但遠遠不能滿足市場需求，所以價格一直居高不下。因此，加緊astaxanthin的產品研製開發，對於生產優質水產品、禽蛋，增強其國際競爭力，具有極大的意義。

目前紅球藻的生活史尚未明朗，沒有一個完整的型態被證實出以及大量生產和如何獲得最大astaxanthin的方法尚未被確立。倘若紅球藻的生活史被確定，而後再發展出一套可大量生產astaxanthin的兩階段養殖方法，以滿足市場的需求，那麼紅球藻的研究將會更備受重視。

 

◎ Typical common components of Haematococcus

 

	Minimum	Maximum	Mean
protein	17.3	27.16	23.62
carbohydrates	36.9	40.0	38.0
fat	7.14	21.22	13.8
iron (%)	0.14	1.0	0.73
moisture	3.0	9.00	6.0
magnesium (%)	0.85	1.4	1.14
calcium (%)	0.93	3.3	1.58
biotin (mg/lb)	0.108	0.665	0.337
L-carnitine (μg/g)	7.0	12	7.5
folic acid (mg/100g)	0.936	1.48	1.30
niacin (mg/lb)	20.2	35.2	29.8
pantothenic acid(mg/lb)	2.80	10.57	6.14
vitamin B1 (mg/lb)	0.050	4.81	2.17
vitamin B2 (mg/lb)	5.17	9.36	7.67
vitamin B6 (mg/lb)	0.659	4.5	1.63
vitamin B12 (mg/lb)	0.381	0.912	0.549
vitamin C (mg/lb)	6.42	82.7	38.86
vitamin E (IU/lb)	58.4	333	186.1
Ash	11.07	24.47	17.71

◎ Typical amino acid analysis of Haematococcus algae

 

	Minimum value	Maximum value	Mean
Tryptophan	0.05	0.56	0.31
aspartic acid	1.37	2.31	1.89
threonine	0.78	1.24	1.04
serine	0.73	1.06	0.94
glutamic acid	1.70	2.39	2.19
proline	0.69	1.00	0.89
glycine	0.84	1.32	1.17
alanine	1.30	1.92	1.73
cysteine	0.16	0.21	0.19
valine	0.83	1.94	1.36
methionine	0.32	0.43	0.40
isoleucine	0.55	0.97	0.79
leucine	1.21	1.84	1.67
tyrosine	0.40	0.63	0.52
phenylalanine	0.61	1.05	0.90
histidine	0.48	0.76	0.61
lysine	0.75	1.32	1.13
arginine	0.81	1.34	1.07

 

◎ Typical fatty acid analysis of Haematococcus algae

 

Fatty acid	Mean	Minimum	Maximum
C12:0 lauric	＜ 0.01	＜ 0.005	0.01
C14:0 myristic	0.07	0.04	0.10