藍綠藻萃取物之「抗菌」研究
李孟洲 海大養殖系博士班
藍綠藻（Cyanobacteria, blue-green algae）在分類學上是屬於藍綠藻門（Cyanophyta），在淡水及海水皆有此原核藻類的存在。藍綠藻之起源約可上溯到三、四十億年前(Schopf and Packer, 1987)，是考古學家、生物學家、地質學家等人，極為重視的古生物物種及活化石。藍綠藻之細胞結構與革蘭氏陰性菌（Gram negative bacteria）類似，但藍綠藻是能行光合作用之自營生物。藍綠藻具有葉綠素，含有多種藻膽蛋白（phycobiliproteins），組成了與高等植物相似的光系統（photosystem I and II），可消耗水與二氧化碳，產生氧氣而釋放於大氣層中(Mundt et al., 2001)。
以生態學之觀點而言，藍綠藻是生態系中之「基礎生產力」，但某些種類的藍綠藻大量地快速增生，亦會造成「水華」（waterblooms）之危害，導致水生動物死亡及公共衛生的問題。養殖池內之藍綠藻過多，也會導致養殖物種風味不佳或有異味，嚴重甚至因為「生物濃縮作用」而導致食用者之毒害(Duy et al., 2000; Mundt et al., 2001)。
以物種間生存競爭之觀點而言，藍綠藻自身所合成的「毒性物質」，可抵禦其他物種之侵略與攻擊，包括細菌、真菌、浮游生物及真核微細藻等(Mundt et al., 2001)。1994年即有研究人員Carmichael, W. W.，在科學期刊「Scientific American」上，以「The toxins of cyanobacteria」為題發表了相關的研究。他發現藍綠藻的「毒性物質」可造成浮游動物的直接死亡，並間接抑制浮游動物的繁衍，而使浮游動物數量減少(Carmichael, 1994)。
就如同肉毒桿菌素在現在醫學及美容之應用，藍綠藻上述的特性對人們而言，便有了新的聯想：是否能從藍綠藻的成分或代謝產物中獲得類似「抗生素」成分，以作為人類對抗病菌之新武器？故有了許多新的研究支持上述的想法。
以抗病毒的活性而言，於1996年，由研究人員Hayakawa, Y.等人從螺旋藻（Spirulina platensis）之熱水萃取物中，發現了一種螺旋藻的生理活性物質，稱之為「螺旋藻含鈣藻膠」（Calcium spirulan, Ca-SP）。Hayakawa, Y.等人並以ex vivo的實驗方式證實Ca-SP具有抑制「單純皰疹病毒」（herpes simplex virus, HSV）與「人類免疫缺乏病毒」（Human Immunodeficiency Virus, HIV）之功效(Hayashi et al., 1996a)。另一組研究人員Lee, J. B.等人更進一步發現，Ca-SP抗病毒之效果，可適用於具有「套膜」之病毒（enveloped virus），包括Herpes simplex virus type 1、human cytomegalovirus、measles virus、mumps virus、influenza A virus，以及HIV-1(Hayashi et al., 1996b)。且研究發現，Ca-SP結構中的鈣離子，在抗病毒之功效中，是不可或缺的成分(Lee et al., 2001)。
以抗真菌的活性為例，於1994年，由Kobayashi, A.等人發表在科學期刊「Zeitschrift fur Naturforschung」上，Kobayashi, A.等人從「地木耳」（Nostoc commune）所純化出的抗真菌劑，稱為「Nostofungicidine」(Kobayashi et al., 1994)，是一種「lipopeptide」，分子式C48H76O18N10，其結構與從Calothrix fusca萃取出的抗真菌劑「Calophycin」、從Anabaena sp.萃取出的抗真菌劑「Puwainaphycin C」、從Microcysis aeruginosa萃取出的抗真菌劑「Microginin」，皆有相似的「苯環」及「peptide chain」結構(Kajiyama et al., 1998)。
在1975年，研究人員Chrost, R. J.便已觀察到，在發生藍綠藻之「水華」水域，其革蘭氏陽性菌（Gram positive bacteria）之菌量相對較少，並推測可能是藍綠藻所產生之抗菌產物所導致(Chrost, 1975)。此外，於1999年，由Jaki, B.等人發表在科學期刊「Journal of Natural Products」上，Jaki, B.等人從培養「地木耳」（N. commune）之培養液中，萃取出一種特殊的細胞外代謝產物，稱之為「noscomin」，與從西洋紫杉樹（Taxus brevifolia）的樹皮中分離出來的一種天然抗癌藥物「紫杉醇」（Paclitaxel，商品名Taxol），同屬於diterpenoid類，具有類似的結構。此成分「noscomin」具有抑制Bacillus cereus、Staphylococcus epidermidis，及Escherichia coli生長之效果。其最小抑制濃度(MIC, Minimum inhibitory concentration)分別為32 ppm、8 ppm、128 ppm (Jaki et al., 1999)。
在2001年，由Mundt, S.等人發表在科學期刊「International Journal of Hygiene and Environmental Health」上，大量篩選了35種藍綠藻，針對「抗病毒」、「抗細菌」、「免疫調節」、「酵素抑制作用」之特性進行in vitro測試。「免疫調節」測試是以「人類週邊單核球」作為實驗材料，體外培養時加入藍綠藻水溶液萃取物，培養三天後觀察細胞增生的情形，增生數量產生變化的實驗組，視為具有調節免疫系統之效果。並同時觀察藍綠藻水溶液萃取物是否有細胞毒性。實驗結果發現：Oscillatoria tenuis、Limnothrix redekei、Synechocystis aquatilis具有調節免疫系統之效果(Mundt et al., 2001)。
「酵素刺激或抑制作用」測試是以「cyclooxygenase」與「lipoxygenase」為對象，在藍綠藻水溶液萃取物存在下，觀察細胞對氧氣的消耗量是否發生變化。另外，「leucine aminopeptidase」及「trypsine」之活性研究則利用受質反應呈色來評估酵素活性的變化。實驗結果發現：僅有Oscillatoria tenuis及Microcystis sp.對「leucine aminopeptidase」有75﹪抑制作用(Mundt et al., 2001)。
「抗細菌」及「抗真菌」測試是以洋菜膠培養皿之菌落擴散圈來評估藍綠藻萃取物之「抗細菌」及「抗真菌」效果。而「抗病毒」測試則以被病毒感染細胞，體外培養時加入藍綠藻萃取物後，被病毒感染細胞所產生之病毒蛋白量多寡來評估，實驗結果則整理於下表(Mundt et al., 2001)。
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藍綠藻種類 |
可對抗之病菌 |
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Oscillatoria sp. |
Bacillus subtilis |
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Nostoc sp. |
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Cylindrospermum majus |
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Calothrix gracilis |
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Anabaena variabilis |
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Gloeocapsa caldariorum |
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Pseudanabaena catenata |
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Limnothrix redekei |
Staphylococcus aureus |
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Micrococcus flavus |
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Bacillus subtilis |
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Nodularia spumigena |
Herpesvirus |
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Synechocystis aquatilis |
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Calothrix gracilis |
Influenza A virus |
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Oscillatoria sp. |
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在2003年，由Huang, R.（黃穰）等人發表在科學期刊「Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology」上，則是從紅藻萃取出「lectin」，發現可抑制Vibrio pelagius與V. vulnificus (Liao et al., 2003)。由以上的例子可發現，種類繁多的藻類是極為豐富的寶藏。面對各種病菌在生存競賽中不斷地以「突變」演化出各種「優勢種」，「抗生素」之篩選與研發是永遠不能停歇的工作。藻類之萃取物除了可直接用於抑制病菌，隨著化學合成技術的進步，藻類之萃取物也可作為抗生素或藥物之「原始材料」或合成反應中之「中間產物」，以利新抗生素或藥物之生產。
2003年十月廿四日驚傳台灣外銷歐洲的水產品共有十一件、超過六十噸不合格，其中有六件驗出使用禁藥氯黴素、五件殘留俗稱「富來頓」的硝基夫喃，由於氯黴素是可能致癌的禁藥，而硝基夫喃是動物用藥，無論台灣或歐盟的漁產品都不能含有這類用藥，否則就必須銷毀（中央社,民921024）。不合格漁產品其種類涵蓋吳郭魚、虱目魚、土虱、調理鰻及蝦類，養殖場分布於高雄縣、屏東縣、台南縣和嘉義縣（中國時報,民921024）。目前養殖業界現況，抗生素的濫用已經對水產養殖漁產品之價格產生極大的影響。事實上，不只水產養殖業，包括畜產業、家禽飼養業等，抗生素的濫用，一直是很嚴重的問題。業者濫用抗生素以求提高養殖密度、避免病害，以降低成本提高獲利，卻也影響人類社會醫療用藥之效果。如能透過養殖池「藻相」的控制，來抑制致病菌的產生，或以「藻萃取物」取代「禁藥」之使用，是為解決養殖業者濫用抗生素之可能方案之一。
在肉食性魚種養殖之過程中，魚體間的撞擊殘食，常造成傷口的感染，如「水黴病」。是否能透過養殖池「藻相」的控制，來抑制「水黴病」的發生，是為一可能的研究方向。但為施藥容易，藥劑型之「藻萃取物」可能較為養殖戶接受。
為篩選可能的抑菌之藻種，首先可製備「藻之熱水萃取物」、「藻之有機溶劑萃取物」及「藻之培養液萃取物」，以求能取得「水溶性」、「油溶性」、及「分泌性」之有效成分。再將上述「藻萃取物」塗佈於細菌、真菌之培養基上，求其「最小抑制濃度(MIC)」，參考已知之抗生素標準品之「最小抑制濃度」做參考，以作為初步篩選。如要篩選「抗病毒」之藻種，則先利用in vitro之方式，於活體外先培養「病毒」之宿主細胞（host cells），在病毒感染前、或感染後，加入「無菌」之藻萃取物，觀察「病毒之蛋白質生成量」、或細胞所生產的病毒之「病毒感染劑量(multiplicity of infection, MOI)」， 以作為初步篩選。
經過初步篩選之有效成分，可利用適合之魚種或魚細胞株檢測其「細胞毒性 (IC50, concentration of 50 % inhibition)」。如細胞毒性太強（IC50數值太小），則不適合使用。
隨後還需瞭解此有效成分，在養殖環境中之安定性，如光照、溫度、鹽度、氨氮濃度等，對抑菌效果是否有影響。如通過以上的測試，便可設計「病菌攻擊試驗」，已瞭解真實使用之抗菌效果。如效果良好，還需考慮對生態環境之衝擊，如半衰期長短、對相關水生物種之危害、生物濃縮作用之劑量等。而近期醫藥界使用「高效能篩選(high throughput screening, HTS) 」之實驗設計及相關儀器，以96孔盤，設計單一步驟之反應結果，供儀器快速判讀，篩選可能的成分以進行更詳細的分析，此系統已成為製藥業與學術單位開發新藥的主流(Barrie et al., 2003; Entzeroth, 2003)。
以此觀之，微細藻之「實驗室大量培養」及「種子化」是篩選過程中極重要的工作。在篩選過程中所需之藻萃取物，需透過實驗室大量培養才能獲得；而重要藻種需以「種子化」才能保存。故微細藻之「實驗室大量培養」及「種子化」，亦是研究之重要主題。
參考文獻
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