以微藻生產氫氣作為再生能源
養研所 博士班 李孟洲
摘 要
「化石燃料」的使用不但造成環境污染，且將面臨開採枯竭，遂有開發其他能源之迫切性。「氫氣」是理想的「再生能源」， 其來源除了「電解」水及其他「化學」之方法外，另可藉由某些「藻」種，在特定之代謝條件下可產生「氫氣」。如「Chlamydomonas reinhardtii（衣藻）」可透過「氫化酵素（hydrogenase）」之作用，在「缺硫」、「無氧」、有「光源」下，暫時性地產生「氫氣」。目前研究人員正積極尋求微藻「量產氫氣」之條件。
關鍵字：藻、能源、氫氣
依據我國「經濟部能源委員會」所發佈之「國內能源供需情勢：九十二年一至九月國內能源供需概況」，文中提到我國「能源供需結構」指出，「進口能源」佔我國「能源供給總額」之97.84﹪，「進口能源」包括原油、煤炭、及來自印尼與馬來西亞的液化天然氣等。再以能源供給之「種類」進行分析，以石油占49.95％最高，其次為煤炭33.08％，核能及水力發電分別占8.08％與1.45％，自產天然氣及進口液化天然氣二者合計占7.45％。由以上之資料可歸納出「化石燃料（fossil fuels）」，包括石油、煤炭、天然氣等，合佔我國「能源供給」總額之90﹪以上(經濟部能源委員會, 2002)。「化石燃料」為主要「能源供給」之現象，是一全球性之趨勢。但許多專家學者一再警告大眾「化石燃料」即將枯竭之警訊，又「化石燃料」的使用還造成許多生態環保之浩劫，遂有開發其他能源之迫切需求。目前除了以「物理」、「化學」之產能方法，正在實驗室積極研究外，環保人士持續積極推廣之產能「概念」，是在自然界中，可不斷循環再生的「再生能源（renewable energy）」(Melis and Happe, 2001; Wunschiers and Lindblad, 2002)。
「再生能源」是指人們可利用生生不息的大自然資源，如：太陽能、風力、水力、生質能、地熱及海洋能等，再經過儀器轉換成為電能，或是加工處理、或直接利用產生熱能(Clay, 2002; Gross et al., 2003)。依據「經濟部能源委員會」所發佈之「國內能源供需情勢：九十二年一至九月國內能源供需概況」，文中提到我國「水力發電」佔我國「能源供給總額」之1.45％(經濟部能源委員會, 2002)。比例雖少，但從「台灣電力公司」所提供之資料，可知道政府及民間企業正設法提高「水力」、「風力」、「太陽能」等「再生能源」運用之比例。民國92年6月底再生能源(含慣常水力、風力、太陽光電、海洋溫差以及波浪發電)裝置容量為191.1萬瓩，佔系統裝置容量5.9%。政府在民國87年5月召開全國能源會議，宣布了在公元2020年，新能源規劃要達到1∼3%的目標。行政院91年8月通過「再生能源發展條例（草案）」，訂定再生能源發電容量獎勵總量為650萬瓩，宣示加強推動再生能源發電之政策(台灣電力公司, 2002)。
在「再生能源」各項中，較少為人知，而政府及民間正開始投入資源研究的項目即是「生質能」，又稱為「生質能源（biomass energy）」、或「生物能源（bioenergy）」。「生質能」是泛指「利用生物產生的有機物質（即生質物, biomass），經過轉換後所獲得之可用能源」(Aristidou and Penttila, 2000; McKendry, 2002)工業技術研究院, 2002; 中時電子報, 2002 )。例如目前台灣地區的「生質能發電應用」有「垃圾焚化發電」及「沼氣發電」二大類，以內湖焚化廠為例，目前已將其產生的部份電力，回售給台電公司，連同其他垃圾焚化發電，總計裝置容量有475.3千瓩。另外，有關「沼氣」之利用方面，在農委會及農林廳的輔導下，以「豬糞尿厭氧消化處理研究」為題，開發各種沼氣利用的途逕。如高雄立大農畜公司，建立200頭豬之「糞尿處理系統」，產生的沼氣直接供燃燒及發電之用。另在台糖公司竹南畜產研究所設立10,000頭豬之「糞尿處理系統」，產生的沼氣做為「170kVA雙燃料引擎」的動力，提供養豬場的電力之需。上述之「垃圾焚化發電」及「沼氣發電」，不但能提供「電能」外，同時減少了大量有機廢棄物，減輕環境之負荷(台灣電力公司, 2002)。
目前的石油、煤炭、天然氣等「化石燃料」，在燃燒後除了產生能量、二氧化碳、及水之外，還有種類繁多的有機化合物散逸在空氣中，造成許多負面的影響，如污染空氣及水源、破壞動物及昆蟲之棲息地、影響植物生長、引發人類呼吸道疾病及癌症等。所以科學界及環保團體不斷的尋求物染度更低的替代燃料，「氫氣」便是理想的候選物之一(Ghirardi et al., 2000; Wunschiers and Lindblad, 2002)。「氫氣」在燃燒後，除了提供能量外，只產生水蒸汽，還不會產生二氧化碳造成「溫室效應」，是非常理想的「燃料」。而「氫氣」的來源，除了一般大家熟知的「電解」水及其他「化學」的方法，可以取得「氫氣」外，目前極為受重視的，就是由某些特定之「藻」種，在有光的環境下產生「氫氣」。又由於這些特定之「藻」種，除了可產生「氫氣」外，又可另外透過「光合作用」使「藻體」獲得養分而成長及增殖，這些增殖的「藻體」又可成為「優良蛋白質」及「健康食品」之來源，使得「藻」成為一種亟待開發之「生質能」標的(Wunschiers and Lindblad, 2002)。
「生物個體」之存活、「生命現象」之表現，最優先之條件在於「能量」之獲得。為了取得「能量」以延續生存，各種生物體「演化」出「最經濟」的方式獲得能量。也為了確保「生存優勢」，各種生物體多半擁有獲取「能量」之「替代方案」，以應付詭譎多變之地球環境。利用光能的「綠色植物」，透過對光能的轉換，產生細胞能利用的「高能物質」－腺嘌呤核咁三磷酸（adenosine triphosphate, ATP）。依據「非循環性電子流（noncyclic electron flow）」學說，對於植物「光合作用」反應機制之描述，在植物細胞內之「類囊體（thylakoid）」上，「光系統II（photosystem II）」之「葉綠素（chlorophyll）」分子會吸收外界環境的「光能」，隨後在「光系統II」之反應中心（reaction-center chlorophyll P680）進行分解「水分子」之反應，產生「氧氣」、「氫質子（proton, H+）」、及「電子（electron, e-）」。其中「電子」會經由「電子傳遞鏈（electron transport chain）」傳送至「光系統I（photosystem I）」，其過程並促成「光合磷酸化作用（photophosphorylation）」之進行，而合成了ATP，供「卡爾文循環（Calvin cycle）」使用，以合成醣類及其他有機物。而已經傳遞至「光系統I」之「電子」，會在「光系統I」之反應中心（reaction-center chlorophyll P700），藉由光能作第二次激發，最後被「NADP+ reductase」接收，參與「NADPH（dihydronicotinamide adenine dinucleotide phosphate）」之合成。而合成「NADPH」與「ATP」之目的，皆是為了提供「卡爾文循環」使用。因為「卡爾文循環」在酵素「rubisco（ribulose bisphosphate carboxylase）」之作用下進行「固碳作用（carbon fixation）」，以合成醣類。上述的機制，簡單地以下列反應流程表示(Benemann, 1997)：
CO2
↓
H2O→PSII→PSI→ferredoxin→rubisco→[CHO] （流程1）
↓
O2
PSII: Photosystem II
PSI: Photosystem I
為了在變化簌忽之環境中，確保「ATP」與「NADPH」之穩定獲得，某些特定之「藻」種可透過特殊的代謝途徑，繼續產生「ATP」與「NADPH」來維持藻體的生存(Winkler et al., 2002b)。因為「ATP」與「NADPH」除了提供「卡爾文循環」使用外，還參與了「藻細胞」中各種生理及代謝的作用。當「綠色植物」轉換光能，分解「水」分子得到「氫質子」及「電子」，以作為「能量」傳遞的「介質」，來產生細胞所需之「ATP」與「NADPH」，同時也產生了「氧氣」這個代謝產物。但是當這些「藻」種遇到特殊的環境變化（stress），便會透過特殊的代謝途徑，來繼續產生「ATP」與「NADPH」，同時也會產生特殊的代謝產物。於1939年，德裔芝加哥大學的研究人員Hans Gaffron，在「Nature」發表了令人驚訝地報告，首先提出在「Scenedesmus obliquus（中國大陸譯名：斜生柵藻）」的培養過程中，發現有「氫氣」的產生(Gaffron, 1939; Gaffron, 1940; Gaffron and Rubin, 1942; Wunschiers and Lindblad, 2002)。這個發現卻在五、六十年後，才在「尋找替代能源」的需求下，開始受到重視。
有關於單細胞藻類產生「氫氣」的研究，目前以「Chlamydomonas reinhardtii（衣藻）」之研究較多，詳如附表一，原核生物亦曾被報導(Appel and Schulz, 1998; Das and Veziroglu, 2001; Tamagnini et al., 2002; Vignais et al., 2001)。研究的關鍵在於目前對於「Chlamydomonas reinhardtii」之「氫化酵素（hydrogenase）」，其基因及酵素之作用機制有較多資訊，加上藻種之取得及培養容易所導致。目前已知會產生「氫氣」的單細胞藻類，其所需的條件不盡相同，推測是其產生「氫氣」之代謝機制不同所導致。以同一藻種而言，不同的培養環境，所誘發產生的「氫氣」產量也會有差異。但總括來說，單細胞藻類產生「氫氣」，是一種「非經常性」的代謝模式，其目的是為了彌補「不能順利進行光合作用產生ATP與NADPH」所產生之代償反應(Appel and Schulz, 1998; Das and Veziroglu, 2001; Tamagnini et al., 2002; Vignais et al., 2001)。
以「Chlamydomonas reinhardtii」產生「氫氣」為例，依據2001年加州大學的研究人員Anastasios Melis與Thomas Happe發表在科學期刊「Plant Physiology」上的實驗步驟(Melis and Happe, 2001)，以一封閉的透明培養瓶，將「Chlamydomonas reinhardtii」在日光下，培養至3∼6×107 cells/ mL，隨後移除含「硫」的營養鹽，此步驟將抑制「光系統II」的作用(Semin et al., 2003)，使得「衣藻」不再分解「水」分子產生「氧氣」、「氫質子」與「電子」。「衣藻」在缺少「硫」的環境下，由於「光系統II」之作用受到抑制，隨即面臨因缺少「電子」而無法順利產生ATP與NADPH的衝擊（stress），故改採用「呼吸作用」，透過「氧化醣類」來獲取藻體所需之能量。約24小時後，水中之溶氧（dissolved oxygen）被消耗殆盡，使得「衣藻」第二次面臨缺少「能量」的危機。
當「衣藻」第二次面臨缺少「能量」時，卻因缺少「硫」，使得「光系統II」仍處於被抑制的狀態下，迫使「衣藻」改採用「第三種」產生能量的代謝模式。在有光源、卻缺少「硫」的「無氧」環境下，在「類囊體」膜上負責進行「光合磷酸化作用」，以產生ATP的「電子傳遞鏈」作用系統，不能再從「光系統II」獲得「電子」。此時，在「葉綠體基質（choroplast stromal）」內的酵素－「NADPH oxido-reductase」(Happe et al., 1994)，開始負起「提供電子」的任務。「NADPH oxido-reductase」會將葉綠體內的「NAD(P)H」氧化成「NAD(P)+」，而「NADPH oxido-reductase」並且將所得到的「電子」傳遞給「電子傳遞鏈」作用系統，去進行「光合磷酸化作用」產生ATP。隨後「電子」仍會經由「電子傳遞鏈」傳送至「光系統I」(Happe and Kaminski, 2002; Melis and Happe, 2001)。
在自然環境中，已經傳遞至「光系統I」之「電子」，會在「光系統I」之反應中心（reaction-center chlorophyll P700），藉由光能作第二次激發，被含有「鐵原子」的酵素「鐵氧化還原蛋白（ferredoxin）」接收，最後再傳遞給「NADP+ reductase」，將「NADP+」還原成「NADPH」，如前述之「流程1」。但在「衣藻」第二次面臨缺少「能量」時，「電子」會由「光系統I」傳遞給另一個亦含有「鐵原子」的特殊酵素，即「氫化酵素（hydrogenase）」。「氫化酵素」會利用所獲得的「電子」，將「氫質子」還原成「氫氣」，而釋出藻體外(Happe and Kaminski, 2002; Melis and Happe, 2001)。以前述的實驗條件下，每小時每公升（1L）的「衣藻」水體，大約可產生2.0∼2.5 mL之「氫氣」，此現象可維持24∼70小時，隨後「氫氣」產量持續減少(Melis and Happe, 2001)。
前述之「NADPH oxido-reductase」會將葉綠體內的「NAD(P)H」氧化成「NAD(P)+」，並且將所得到的「電子」傳遞給「電子傳遞鏈」作用系統，進行ATP的合成。但追溯「NADPH oxido-reductase」氧化「NAD(P)H」之反應動力，推測可能是透過「氧化藻體內之醣類或蛋白質」所獲得的，例如發生在細胞質（cytoplasm）內的「醣解作用（glycolysis）」或「三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle）」(Happe and Kaminski, 2002; Melis and Happe, 2001)。也因此在產生「氫氣」24小時後，藻體的重量開始遞減(Melis and Happe, 2001)。
當「氫氣」產量明顯減少時，只需恢復培養液中，含「硫」營養鹽的供給，在日光下藻體隨即可進行「典型的」光合作用反應，產生「氧氣」，而藻體的數目並沒有明顯的差異，藻體外型也會從「橢球」狀恢復成飽滿的「圓球」狀(Melis and Happe, 2001)。並且可再重複前述「產生氫氣」的過程，可說是對「藻類」盡其最大之利用，也堪稱是「再生能源」極佳的典範。
但將「量產氫氣」之重責大任，寄予在單細胞藻類「非經常性」的代謝模式上，是否過於樂觀？隨著「分子生物學」及其技術之日新月異，目前既然已掌握多種物種之「氫化酵素」基因及其蛋白質結構(Appel and Schulz, 1998; Das and Veziroglu, 2001; Tamagnini et al., 2002; Vignais et al., 2001; Winkler et al., 2002a)，再配合更多關於「氫化酵素」生化及代謝之知識，發展「氫化酵素」之誘導劑（inducers）或相關酵素之抑制劑（inhibitors）、或是篩選氫化酵素「基因過渡表現（gene over-expression）」之藻種，配合「微藻培養技術」及「微藻固定化技術」之精進，是可以實現單細胞藻類「量產氫氣」的想法，作為「再生能源」取代「化石燃料」的使用，以下便舉一實驗為例說明上述觀點的可行性。
從前面的說明可以發現，「光系統II」的抑制，是促使「衣藻」產生「氫氣」的首要步驟(Semin et al., 2003)。而在1933年，即已發現一種特殊的化合物：3-(3, 4-dichlorophenyl)-1, 1-dimethylurea（DCMU），可專一性地抑制「光系統II」的作用(Florin et al., 2001; Happe and Naber, 1993)。故可先將「衣藻」在「缺氧」且「無光源」的環境下，加入「光系統II」的抑制「DCMU」培養一段時間，待「衣藻」將水中之溶氧經由「呼吸作用」消耗殆盡後，再給予「光源」繼續培養，由於「光系統II」受到「DCMU」的抑制，此時便會產生大量「氫氣」(Melis and Happe, 2001)。前述的現象不需要再移除培養基中含「硫」營養鹽的供給，即可促使「衣藻」產生「氫氣」。前述「衣藻」產生「氫氣」的機制，簡單地以下列反應流程表示(Benemann, 1997)：
[CHO]→PSI→ferredoxin→hydrogenase→H2 （流程2）
↓
CO2
又由於「衣藻」在「缺氧」且「無光源」的環境下，也會進行「發酵作用（fermentation）」以取得「能量」(Benemann, 1997; Happe and Kaminski, 2002; Melis and Happe, 2001)。故亦有研究人員推測，「氧化藻體內之醣類或蛋白質」所獲得的「電子」，可能不需經過「光系統I」之激發，即可由含有「鐵原子」的「氫化酵素」接收而產生「氫氣」，簡單地以下列反應流程表示(Benemann, 1997)：
[CHO]→ferredoxin→hydrogenase→H2 （流程3）
↓
CO2
目前除了對「藻類」的「代謝作用」，有了初步的瞭解外，對於「氫化酵素」之酵素作用及其基因也有一些認識。以目前現現有之研究，大致上可將「氫化酵素」分為三類(Appel and Schulz, 1998; Das and Veziroglu, 2001; Tamagnini et al., 2002; Vignais et al., 2001)：第一類是「典型的可逆性氫化酵素」（reversible or classical hydrogenase），此類酵素會依細胞內的生化條件，進行「將氫質子還原成氫氣」或是其相反之代謝反應。此類酵素通常需要「電子攜帶者（electron carrier）」的協助，如前述「衣藻」的「氫化酵素」即屬此類。「衣藻」的「氫化酵素」，自「光系統I」所獲得的「電子」，便是藉由「鐵氧化還原蛋白（ferredoxin）」的協助，將「電子」自「光系統I」傳遞至「氫化酵素」，如上述之「流程2」。
第二類「氫化酵素」是屬於「膜上型（membrane-bound）」的，其作用是可利用氫氣，產生「氫質子」將「NADP+」還原成「NADPH」，故不產生氫氣。第三類的「氫化酵素」就是「固氮酵素（nitrogenase）」，到目前為止，僅在部分的細菌與藍綠藻（cyanobacteria, blue-green algae）才有發現此類酵素。「氫氣」是此酵素進行「固氮作用（nitrogen fixation）」時的副產物，並且為一不可逆之反應(Das and Veziroglu, 2001; Tamagnini et al., 2002; Vignais et al., 2001)。
由於「氫化酵素」的作用實際上就是「氧化還原反應」，故「氫化酵素」多半含有「金屬原子」以作為「電子接受者（electron acceptor）」。若以「氫化酵素」所含有之「金屬原子」做分類依據，亦是可將「氫化酵素」分為三類(Happe and Kaminski, 2002)：第一類是同時含有「鎳原子」及「鐵原子」的「氫化酵素」（nickel-iron hydrogenase, NiFe-hydrogenase）；第二類是含有「鐵原子」的「氫化酵素」（Fe-hydrogenase）；第三類則是不含「金屬原子」的「氫化酵素」，目前僅有「古細菌（Archaea）」才有發現此類酵素。而前述「衣藻」的「氫化酵素」，即是含有「鐵原子」的「氫化酵素」。
目前已有研究說明含有「鐵原子」的「氫化酵素」，其「氨基酸」及「基因」序列(Das and Veziroglu, 2001; Tamagnini et al., 2002; Vignais et al., 2001)。「衣藻」的「Fe-hydrogenase」蛋白是由497個氨基酸組成、「Scenedesmus obliquus」的「Fe-hydrogenase」為448個氨基酸組成、「Scenedesmus vacuolatus」的「Fe-hydrogenase」為436個氨基酸組成、土壤厭氧菌「巴斯德氏梭狀芽胞桿菌（Clostridium pasteurianum）」的「Fe-hydrogenase」為574個氨基酸組成。這些不同物種的「Fe-hydrogenase」皆來自相同的基因「HydA」，並推測還有另一個基因「HydB」存在「衣藻」及「Scenedesmus obliquus」中，可產生「氨基酸」序列稍有差異的「Fe-hydrogenase」(Winkler et al., 2002b)。雖然有了上述有關「Fe-hydrogenase」生化代謝、蛋白質結構、及基因的研究，但還有幾個問題值得吾人再探討的。
首先，基因「HydA」並非「恆常的（constitutive）」表現，而是需要「無氧」環境的誘導(Winkler et al., 2002b; Wunschiers and Lindblad, 2002)。這也是前述「衣藻產生氫氣」的實驗中，需要一段「無光」、「無氧」的環境，讓「衣藻」進行「呼吸作用」把水中的「溶氧」消耗掉，才能誘導「衣藻」在「光源下」產生氫氣。故以「選種」或「基因工程」，得到能「大量表現」氫化酵素的「藻種」，是實現「藻類量產氫氣」的首要條件。若能得到在「有氧」環境下，依然能進行「產氫」（O2-tolerant H2-production）的「藻種」，操作起來更是方便而有效率(Flynn et al., 2002)。
其次，要實現「藻類量產氫氣」，需要克服在無氧環境下，「藻體」的代謝趨勢，是偏向進行「發酵作用」，而並非上述之「流程2」及「流程3」、會產生「氫氣」的「光發酵作用（photo-fermentation）」。「藻體」的「發酵作用」，是透過酵素「丙酮酸脫羧酵素（pyruvate decarboxylase）」及「醇脫氫酵素（alcohol dehydrogenase）」，消耗「藻體內」的「丙酮酸（pyruvate）」及「氫質子」，會產生「二氧化碳」、「酒精」、及「甲酸鹽（formate）」，而減少「氫氣」的生成(Winkler et al., 2002b)。為解決這個問題，除了透過「選種」或「基因工程」，得到能「大量表現」氫化酵素的「藻種」之外，還可發展「發酵作用」相關酵素之「抑制劑」，或「氫化酵素」的「促進劑」，以實現「藻類量產氫氣」，作為「再生能源」之使用。
附表一 已被科學期刊發表之產「氫氣」的單細胞藻類
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Name |
References |
Scenedesmus obliquus |
(Gaffron, 1939) |
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Chlamydomonas reinhardtii |
(Happe and Kaminski, 2002) |
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Chlamydomonas moewusii |
(Winkler et al., 2002b) |
|
Chlamydomonas noctigama |
(Winkler et al., 2002b) |
|
Lobochlamys segnis |
(Winkler et al., 2002b) |
|
Scenedesmus vacuolatus |
(Winkler et al., 2002a) |
|
Chlorella fusca |
(Winkler et al., 2002a) |
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Chlorococcum littorale |
(Ueno et al., 1999) |
參 考 資 料
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