農委會89年研究成果報告

一、中文摘要：

在實驗室中培養一種微細綠藻柵藻(Scenedesmus quadricauda)，並將其包埋在褐藻膠珠(alginate-beads)中做為長期培養之用。這些被包埋在褐藻膠珠的柵藻被保存在黑暗中，且在不添加任何培養液下，長達三年之後仍然存活，並且維持其正常生理活性。將這些藻膠珠重新培養於液體培養液中4星期後，它們的數目增加了約40倍。被包埋的柵藻經長期保存後，在電子顯微鏡的觀察下，發現它們的胞器，蛋白核消失了。但是，將這些柵藻重新培養於具有光照的液體培養液中，它們會重新再構成它們的蛋白核。這些結果顯示長期保存的柵藻，是靠消耗蛋白核上的澱粉鞘來存活的。在含有柵藻珠的魚類養殖組其水質中氨氮的濃度明顯下降。因此，固定化於褐藻膠珠的微藻，特別是柵藻這品種，可做為在實驗室中微藻藻種的長期保存，並且可供利用來作為魚類養殖之水質控制。

關鍵字：固定化，微藻，柵藻(Scenedesmus quadricauda)，掃描式電顯(SEM)，穿透式電顯(TEM)，水質。

二、前言：

有關細胞、藻類、細菌及高等植物細胞培養等之固定化方面之研究，已陸續被發表。這些報告支持被固定化的細胞，仍然維持其新陳代謝的活力及效率，如同其在正常的狀況般的觀念。固定化的藻類細胞可避免被水流沖走或被草食性生物吃掉。固定化的藻類被保存在4℃下，於黑暗中超過一年後，仍然能夠恢復正常的生長(Faafent et al., 1994)。被固定化的藻類已被實際應用於，去除廢水中的營養鹽及重金屬(Chevalier and de la Noüe, 1985, Wilkinson et al, 1990, Proulx and de la Noüe, 1988, Garbisu et al, 1991)。包埋貯存於褐藻膠的過程，對藻類品種之保存及養殖管理是非常有幫助的。褐藻膠的製備比其它的方法，例如冷凍保存法來得容易、便宜且隨時可利用(Romo and Pérez-Martínez, 1997)。

如同上面所言，固定化藻類主要是應用於廢水處理。僅有少數的研究報導有關應用固定化藻類於水產養殖方面，例如魚類養殖水水質的控制。本研究的目的，是要研究應用藻類固定化技術於一種微藻四尾柵藻(Scenedesmus quadricauda)品種保存的可行性及測試其在長久保存後的活性。被固定於褐藻膠珠的柵藻亦嘗試被應用於魚類養殖水之控制。

三、材料及方法：

三－一，微藻之培養：

柵藻(Scenedesmus quadricauda)是於國立台灣海洋大學水產養殖學系的魚類養殖池中，分離純化而來。純化的柵藻是培養於含600毫升培養液(PEF medium, pH7) (Provasoli and Pintner, 1960)的一公升三角燒瓶內，於100μmol photons.m^-2.s^-1的光照，12小時亮:12小時暗的光週，及24℃下培養。培養液每週更換一次。

三－二，微藻的固定化：

配製3%(v/v)的褐藻膠(Sigma A-7128)液，並於高溫滅菌斧中(121℃)下滅菌20分鐘。將柵藻培養液以離心機離心(10min. 1000xg (r.c.f))，以濃縮之。然後將柵藻和褐藻膠液均勻地混合。利用血球計數器計算柵藻的數目，而將褐藻膠液的柵藻濃度控制在約2-30000個coenobia/每毫升。將含有柵藻的褐藻膠液以滴管吸取後於室溫中，滴於0.03M的氯化鈣(CaCl₂)液體內以形成褐藻膠珠(約4mm之直徑)。在本實驗中，一毫升的褐藻膠-柵藻液恰好可滴成十粒褐藻膠珠。這些褐藻膠珠浸泡於氯化鈣液內30分鐘以硬化之，然後再以滅菌過的蒸餾水加以沖洗，以去除殘餘之氯化鈣液。這些潮溼的褐藻膠珠被直接保存在密封的三角燒瓶內，其內不添加任何的培養液。三角燒瓶外以鋁鉑紙包裹，以確保保持於黑暗中，並置於4℃下保存，以避免柵藻的持續生長。經長期保存後的含柵藻的褐藻膠珠，在經過重新培養後，其藻數的計數方法是將100粒藻珠，溶於6毫升5%的六偏磷酸鈉(sodium hexameta phosphate)及24毫升的PEF培養液中(Romo and Pérez-Martínez,1997)，然後用血球計數器，計算柵藻之數目。

三－三，製備藻類標本作為電子顯微鏡的研究：

將剛製成的藻珠、長期保存後的藻珠以及重新培養過的藻珠，分別小心地壓成碎片。將這些藻珠小碎片以及以離心管收集的一般柵藻，以含有0.1M蔗糖(sucrose)，4%戊二醇(glutaraldehyde)及0.1M二甲砷酸鈉緩衝液(sodium cacodylate buffer)(pH7.0)之固定液於4℃下，固定2小時。然後，再將這些標本以含有10mM氯化鈣的0.1M二甲砷酸鈉緩衝液(不含蔗糖)沖洗數次。

這些標本是以含有2%四氧化鋨(OsO₄)及10mM氯化鈣的0.1M二甲砷酸鈉緩衝液內於4℃下浸泡1小時，做後固定。最後以含10mM氯化鈣的0.1M二甲砷酸鈉緩衝液沖洗數次。接著，在50%的酒精浸泡3次，然後以50、70、85、95至100%的酒精漸次脫水。

在穿透式電子顯鏡方面，脫水過之標本先浸泡於氧化丙烯(propylene oxide)中3次，每次30分鐘，接著先在2:1的氧化丙烯：Spruu's樹脂液(Spurr, 1969)中做滲透，再於1：1的濃度下滲透，每次4小時。最後，這些標本再浸泡在純的Spurr's樹脂液中，4℃下，2天後再加以固化。超微切片是以醋酸醯鈾(uranyl acetate)及檸檬酸鉛(lead citrate)加以染色(Smith and croft, 1991)。

在掃描式電子顯微鏡方面，脫水過之標本，先小心滴在標本台上，然後以臨界點乾燥機(Hitachi-HCP-1)做乾燥，最後置於鍍金機(Joel, JCF-1100E)中鍍金220秒。

三－四，應用柵藻珠做為魚類養殖之水質控制：

四個玻璃缸(60 ×55 ×33公分)，分別標示為第1、2、3及4組，每個缸子各含100公升之淡水，及10隻平均體長14公分之雄性吳郭魚(Oreochromis mossasmbicus)。第1及2組培養在100μmol photons.m^-2.s^-1的光照及24℃下。第3及4組培養在相同的光照及24℃下，但設定12小時亮：12小時暗之光週(即早上8點開始光亮，晚上8點開始黑暗)。

剛製成的柵藻珠(約2-3000個coenobia/每珠)(圖一)，先培養於PEF培養液中2星期後，再分別以3個尼龍網袋包裹(網孔直徑約為2 ×3mm)(圖二)4000顆柵藻珠。此3個包裹有柵藻珠之尼龍網袋分別掛於第2、3及4組之水缸內。在第4組之水缸，它的尼龍網袋在晚上8點(開始黑暗時)被移走，直到早上8點(光照開始時)再掛回去。第一組則為控制組，其僅含有吳郭魚。這4組魚缸每天均餵食一次2.5公克之飼料(Abon, Taiwan)。飼料成份為45%蛋白質，5%脂肪，3%粗纖維，10%灰份及10%水份。一台酸鹼測定儀(Suntex, Taiwan)，一台數位式溶氧測定儀(Lutron DO-5510, Taiwan)及總氨氮色層測試組件(Aquamerk Ammonium, Merck, Germany)分別用於測定這些水缸的酸鹼值、溶氧及總氨氮濃度。第1及2組水缸每天測定一次，第3及4組則每天二次(早上8點及晚上8點各一次)。各組水缸均加以適度地打氣13天，然後從第14天至18天停止打氣。

四、結果:

四－一，固定化藻類的保存、培養及電子顯微鏡之研究：

剛製成之柵藻珠(圖1)，每粒平均含有2470±460個柵藻(Scenedesmus quadricauda) coenobia。這些溼的柵藻珠在沒有添加任何培養液下，於黑暗中，4℃下被保存了三年。這些柵藻在長期貯存之後並沒有喪失它們的生殖能力，並且它們的數目，如同剛製成的柵藻珠內的柵藻數目一樣，並沒有減少。當它們在PEF培養4星期後，柵藻數目(coenobia)大量增加至9 ×104 ±2300個coenobia(圖1)。

剛製成的柵藻珠的超微切片(圖3)顯示，一個由類囊體堆疊而成的大葉綠體充滿在柵藻細胞內，其為主要之胞器。這個葉綠體內含有由數個澱粉鞘所包圍的蛋白核。這表示剛被固定化的柵藻細胞的超微構造，是和一般正常自由浮動的柵藻細胞構造相同，並無所改變。相對地，經過長期保存的柵藻，其超微構造的觀察中發現，雖然其細胞內仍有一個大葉綠體，但其內的蛋白核消失不見了(圖4)。但是，將這些長期保存之柵藻珠再培養於PEF培養液，於100μmol photons.m^-2.s^-1，光週期12小時光亮:12小時黑暗，24℃下，一星期後，蛋白核會被再重建而出現。

在掃描式電子顯微鏡的觀察下，發現在柵藻珠小碎片內被固定化的柵藻(圖5)形態，除了其4根尾刺變得彎曲外，並沒有其它的變化，它的外在形態和一般的柵藻者(圖6)並無兩樣。

四－二，應用柵藻珠做為魚類養殖水之控制：

四－二－一，魚類養殖水之氨氮濃度：

如圖7所顯示，第一組的氨氮濃度在一個星期內，快速地上昇至17mg/l。因此，第一組的養殖水在第七天晚上8點，即加以更換。但是，在換完水後，在第8天至第18天的培養期間，其水中氨氮濃度仍然顯示出增加之趨勢，由1.5增至15mg/l。

相對地，第2、3及4組的氨氮濃度則較低，在此13天的培養期間，總平均只有5.01mg/l。第2、3及4組的平均氨氮濃度分別為4.85、4.96及5.24mg/l。在第14-18天中，即停止打氣後的培養期間，第2、3及4組的平均氨氮濃度，則分別為0.66、2.25及2.38mg/l。

四－二－二，魚類養殖水之溶氧度：

如同圖8所顯示，所有的培養組在有打氣的狀況下，它們的溶氧均在7mg/l左右。但是，在停止打氣後，各組之溶氧則有顯著的差別。在停止打氣後(14-18天中)，第2組的溶氧最高為4.8mg/l(平均為4.16mg/l)，而第3組的溶氧變化最大為，1.7±0.8mg/l。第4組之溶氧最穩定，平均在2.2mg/l。第一組(控制組)的溶氧則為最低，平均只有0.96mg/l。很明顯地，當停止打氣時，藻類確實能增加水中之溶氧。

四－二－三，魚類養殖水之酸鹼值：

如同圖9所顯示，在有打氣時，第3組的酸鹼值的變化最大。但是，各組的平均酸鹼值卻非常的相近，第1、2、3及4組的平均酸鹼值分別為7.72、7.78、7.70及7.71。相對地，當停止打氣後各組的酸鹼值均下降。第1組的平均酸鹼值為7.46。但是，其它含有藻類的三組其酸鹼值均很接近7.0。其中，第2組為7.16，第3組為6.96，第4組為7.07。這結果表示當停止打氣時，藻類確實會控制魚類養殖之水質接近中性之酸鹼值。

四－二－四，吳郭魚的成長：

在18天的養殖後，第1組的吳郭魚的平均體長為14.5±0.3公分，其成長最差。第2組為16.3±0.2公分，為成長最好的一組。第3組則為15.1±0.3公分。第4組為15.5±0.2公分。

五、討論：

以褐藻膠珠的方法來固定化藻類有以下之好處：(1)藻珠十分容易製備且比冷凍保存法來得便宜及方便使用，(2)藻珠可以保存在一般的冰箱中，(3)固定化的藻類可以很快地恢復自由至一般液體培養中。Romo and Pérez-Martínez(1997)曾報告，在另外一種柵藻(Scenedesmus obliquus (Turp) Kütz)的研究中，亦有相同的以上滿意的結果。本研究證實此固定化技術亦可應用於四尾柵藻(S. quadricauda)。此外，不添加任何培養液的藻珠，被直接保存在黑暗中，於4℃下，超過三年後，當重新培養在新鮮的培養液中，它們能夠成長，並且開始形成新的藻類培養組。經重新培養的藻珠其內柵藻之數目可達9×10⁴ coenobia/每珠，這個數目和一般培養者的藻數相同。Tamponnet et al. (1985)亦有這方面相似的結果，他們曾指出固定化的裸藻(Euglena gracilis)曾被保存在褐藻膠內長達二年以上。在這裡必須指出，被包埋於褐藻膠內的藻類，在適當地培養下，仍有可能繼續生長，這亦表示藻類在褐藻膠珠內仍可維持其活性。

四尾柵藻(S. quadricauda)能夠在褐藻膠珠內，在黑暗中，於低溫下，能夠長期的存活，主要的理由是它們的蛋白核的澱粉鞘提供它們生存上，基本的需求物質。在穿透式電子顯微鏡的觀察顯示出當柵藻珠在長期保存後，柵藻細胞內的蛋白核消失不見了。然而，當它們重新被培養於有光照的液體培養液中，蛋白核會被再重建。另外，在掃描式電子顯微鏡的觀察，發現被包埋的柵藻其外表形態除了尾刺變彎外，其和一般的柵藻並無很大的差別。

在本研究，含有柵藻珠的魚類養殖組中的氨氮，被固定化的柵藻當成營養鹽而吸收，因此造成水質中氨氮濃度下降。在本實驗的18天培養期間，固定化柵藻的數量增加了約15倍。這結果証明柵藻的生理活性，不會因固定化而受干擾。因此，固定化之藻類能夠成功地被利用於魚類養殖水質之控制。Chevalier and de la Noüe (1985)亦曾報導，被固定於鹿角藻膠(κ-carrageenan)珠內的柵藻細胞，能夠像一般的柵藻有效地吸收氨。

本研究發現，在有打氣狀況下，各實驗組的溶氧及酸鹼值均維持在魚類可存活的水準。但是當打氣停止時，含有柵藻珠的養殖組的氨氮濃度，比它們在有打氣時，來得更低。這可能是吳郭魚在突然沒有打氣狀況下(低溶氧)，反應出較低的新陳代謝率及較少的排泄作用，而造成氨氮濃度減少之原因。

雖然，含有柵藻珠之實驗組在有打氣下，其酸鹼值均接近7.0，但是其中第3組的酸鹼值變化最大。相對地，第4組的酸鹼值最為穩定。第3及4組均是在12光亮:12黑暗的光週下培養，但是第4組的柵藻是在黑暗一開始就被移走，直到光照開始時才被放回去。在本研究中，被固定化的柵藻細胞只要直接地把尼龍網袋拿走，即可以很容易地立即被從水中移走。因此，可以避免在黑暗中，藻類在水中進行呼吸作用，而影響到水質。相對地，在一般的藻類培養中，是不可能把水中所有的藻類完全移走。

根據本研究的氨氮、溶氧、酸鹼值(圖7、8及9)及吳郭魚的成長等資料，清楚的指出含有柵藻珠的養殖組(第2、3及4組)的水質比不含柵藻的養殖組(第1組)來得好。也就是，養殖組的柵藻珠確實能夠控制養殖水至適合吳郭魚生長的水質。

六、結論：

本研究成功地將微細綠藻柵藻被包埋在褐藻膠珠中，它們仍然能維持它們正常的生理活性，且在褐藻膠珠裏，如同一般藻類般的生長。因此，本研究之固定化技術，是非常適合用來做為藻類品的種長期保存(藻類之保種)，並且可應用於水產養殖水質之控制。

七、圖解：

圖1-2：柵藻珠。圖1，(a)：經過長期保存之柵藻珠，其內約含有2500個coenobia。(b)：經過重新培養於有光照的PEF培養液中2星期的，經過保存的柵藻珠，其約含有20000個coenobia，(c)：經過重新培養於有光照的PEF培養液中4星期的，經過保存的柵藻珠，其約含有90000個coenobia。圖2，被包裹於尼龍網袋內的柵藻珠。

圖3-6：柵藻之超微構造。圖3-4：穿透式電子顯鏡之觀察。圖3，由類囊體(TH)堆疊而成的大葉綠體(CH)充滿了整個細胞，在棄綠體內有一個蛋白核(P)。CW：細胞壁。SC：澱粉鞘。圖4，經過長期保存後柵藻之超微構造。柵藻細胞內僅有由類囊體