Chapter II 第二章  回頁首

選種及準備(Selection and preparation):

  1. Choice of material

For morphological or physiological study形態及生理上之研究﹕

A. 被動。A start may be made by finding out what will grow from among a mixture of forms, such as are found in a pool, ditch, etc.（誰將長出來?）
B.主動。A search could be made from a population practically composed of one species.（一個族群實際上是由一個品種所構成）
（優勢種→水華→較易分離出單一品種。）

M 以上二者：but both tend to afford only such species as will readily grow under certain conditions.

C.以特定棲息地、特定分類組來挑出特定品種。

Affords most interesting results and consists in picking out single specimens from a mixture, with a view to analysing the algal flora of a certain habitat or to the isolation of certain species belonging to a definite taxonomic group.

M 由野外→好不容易養出一隻來→養一陣子→不見了？？

  1. Preparatory cultures:預備培養

以不同方法（環境），來獲知適合藻類生存及增殖的狀況。

 §Pure cultures are sometimes only obtained after a tedious and wearisome procedure. §

→§由healthy culture來養較可能成功。§

(however, successive attempts are possible, and we can learn from failures until our efforts are crowned with success)

M先在無機→? 特殊加富營養鹽→? 土壤-水

土壤-水之加富培養法(Soil-and-water cultures)的理由︰

  1. Preparatory cultures on nutritive solutions.

The use of solutions of inorganic salts in preparatory culture is advisable for various reasons. Their composition can often be made to approximate to that of the natural medium.（模倣自然生態）

Inorganic solutions favorable to the growth of a species increase the number of individuals, while bacteria and other unwelcome organisms are diminished in comparison to the original mixture.（理想的藻類營養鹽）

B. Enrichment cultures.

Since there are certainly ecological differences between those algal communities which are dependent on special conditions, it should be possible to favor the growth of certain forms in a mixture, while hindering that of other. This can be effected by choosing appropriate media, H.-ion concentrations, temperatures and so on.

**以特定之培養環境如溫度、pH值來獲得特定的藻類，然而實際上並沒有如期待般的成果，主要可解釋的為…競爭competition.

此外：Algae from natural habitats with a high H.-ion concentration (e.g. bogs) may be expected to grow only in media of about same pH. It is seldom possible to produce enrichment cultures of a single species by inoculating it into a medium of low pH, because all species are adapted to nearly the same pH. They must differ in other ecological respects.

以鐵為例：

鐵之濃度？不知是以Fe3+還是以Fe2+存在；because ferrous (Fe2+)compounds are readily oxidized, and ferric (Fe3+) ones are insoluble unless the medium is so acid as to make every kind of life impossible.

其它如氧之濃度(oxygen pressure)、硫化氫等亦不明暸。

在無機營養鹽中可以大量繁殖的藻類，並不代表它們就不需要有機營養鹽類；（有時在無機營養鹽中可以大量繁殖的藻類，卻無法subculture）

In view of these results attempts were made to imitate natural conditions still more closely than by adding soil extract. This led to the soil-and-water culture method, which proved to be surprisingly helpful in cultivating many kinds of small organisms.

Putrefaction cultures（腐敗培養法）﹕

Such cultures, containing organic substances and soil, imitate the conditions in those natural habitats which are usually described as eutrophic. Where the aquatic flora is rich, the bottom mud with its decaying organic residues fertilizes the water. The soil is used as a substitute for mud. Organic material, such as starch or wheat grains, etc., represents organic remains.（以土壤代替底泥,以澱粉或小麥代替有機物質。 ）

The best kind of soil is ordinary sandy garden loam, not too rich in clay or humus. Plain sand is unsuitable.

The employment of large vessels is unnecessary with this ‘putrefaction-culture’ method, ordinary test-tubes being suitable.

 §土壤的功用：釋放微量元素，緩衝高濃度營養鹽，吸收有毒物質等等。§

3. Other preparatory treatment其它預養前的處理方法﹕

Centrifuging. 離心只能減少細菌的數目。

Tactic movements.趨性

Geo- and phototactic movements are useful as a means of obtaining concentrations of algal zoospores and of flagellates, as well as their separation from germs which respond in a different way.

It is not always easy to put this kind of purification into practice, since most zoospores are motile only during a restricted period. Both they and flagellates tend to come to rest and to become attached to the walls o0f the containing vessels when transferred to another medium, especially when this procedure is repeated several times.

Isolation of single cells.(此法最好)

Pipetting method, which consists in transferring single cells with capillary pipettes into vessels containing a suitable medium.

可以由mixture中直接分離出單隻想要的藻種，然後培養出此藻種之純培養。

在實驗中可控制細菌之數量，使藻類較易存活（產生healthy cell）

 技巧要熟練

 缺點﹕要有巧手

 缺點﹕被藻類的大小及特性所限制

(motile flagellates及zoospores﹐因會動較易辨識且較無細菌之污染)並不只限於游泳之藻類，像浮游性藻類亦可用毛細管法。

 缺點﹕固著性藻類較不易被吸上來，需有耐心重覆操  練。

D. Methods of obtaining clean cells.
M 因會動的藻類較不會被細菌沾上（寄生），因此分離會動之藻類可避免細菌污染。C 要使藻類產生會游動的細胞需視藻類的生理狀況而定。

 cysts及young daughter cells﹕較無細菌的污染。

 cysts﹕因為厚殼孢子在萌發時是脫殼而出,因此可以避免細菌的污染。

 young daughter cells﹕在快速分裂的藻細胞﹐較不會殘存有由母細胞而來之細菌。

如何產生會動的藻類F

(1). when algae are transferred from moist to liquid media﹐（由潮溼的環境換到液態之環境）

(2). from flowing, well-aerated, water to a vessel in the laboratory﹐（由流動及通氣良好的水移入實驗室的培養瓶時）

(3). when algae are provided with fresh nutriment after the old medium has been exhausted﹐（在舊培養鹽用盡而添加新鮮的培養鹽時）

(4). when algal material is kept in the dark for more than a single night and subsequently exposed to a suitable illumination（當藻類放在黑暗中超過一晚﹐然後再置於適當之光照下）

Sometimes changes other than those above mentioned prove effective, for instance, a rise in temperature, dilution of the medium, aeration, etc.

　

Chapter III 第三章

藻類生長的工具及營養鹽Implements and media for growing algae﹕

1.水及培養器皿Water and containing vessels﹕

A.水Water﹕

*以前用銅器來蒸餾，銅可能對藻類有害。現已改用玻璃蒸餾。

*用玻璃蒸餾器皿可能有矽鹽產生，故用白金，但仍無法去除重金屬，如能加長白金管之長度可獲得滿意的結果。

*由於白金很貴，而玻璃便宜，亦有改用石英的，特別是要避免有矽鹽產生時用錫器來蒸餾亦不錯。

*要注意水中的氯。

 

*揮發性物質如果進入水中﹐可能造成自營性藻類的氮固定及其它營養性需求的實驗結果產生誤差。如果空氣中的揮發性物質進入水中，可加入過錳酸鉀及硫酸來摧毀這些物質。
M非揮發性微量元素，也可能在水沸騰中氣泡破裂形成水滴進入水中而被帶入，此時可加入染劑來測試是否受到污染。

在玻璃器皿的前端的管子加以折彎就可以避免被污染。
M由於蒸餾水在大量使用時會覺得很貴，因此用自來水或泉水較合算，但自來水及泉水的硬度需注意。因此在使用自來水及泉水時要先煮沸或用可改變硬度的器具來改變其硬度。在煮沸時亦可去除氯，或用活性碳來除氯。
M在硬水中加碳酸鈣有用！特別是對於在自然界中生長於富含石灰環境的藻類特別有用。碳酸鈣亦可中和營養鹽培養液的酸度。

以人工海水養矽藻結果矽藻不長，但加入１%天然海水，則可以生長，在加入４%天然海水則長得比培養在全天然海水好。
M表示出海水中有矽藻所必須的某些成份，而且在天然海水中其濃度可能太高！！

培養器皿。Culture vessels. 通常是使用硬質玻璃器皿做為培養瓶。

For the majority of algal investigations large vessels are not requisite and test-tube suffice. 用試管﹕1.便宜 2.容易操作 3.不佔空間4.易收藏。

Moreover, a smaller quantity of medium is required. In rare instances substances released from the glass are helpful. Thus, silica for diatoms and other algae is most simply provided by use of soft glass. Sometime other, not yet fully known, substances are provided by the glass.

M如果要研究矽的需求﹐用玻璃瓶就不好

§用一般玻璃瓶﹐內部覆蓋一層臘。§
此時不能用玻璃器皿蒸餾的水，只能用白金或錫蒸餾水。

（如何覆蓋一層臘？ …）

如果研究某化學元素不能使用硬玻璃及覆蓋臘之方法時，則須使用石英玻璃器皿，除了易打破及不可在強鹼下加熱﹐它可其代硬玻璃。

(rock algae 用陶器來培養有很好的效果。）

 橡膠塞可能含有硫化物其對藻類可能有害。

2. 無機（礦物）培養液Mineral solutions﹕

 能行光合作用的藻類並非完全不須有機化合物作為營養鹽，某一些品種的裸藻就須有機氮來做為CO2的同化作用，雖然尚未被確定，但是很多含葉綠素的藻類﹐在提供有機化合物下，生長得更好。 （有機化合物例如﹕消化蛋白、糖、脂肪酸等）。
M雖然如此，但是無機營養鹽仍被廣泛使用==藻類雖在無機營養鹽下﹐長得比有添加有機營養鹽來得差，但為了避免某些污染，必須使用無機營養鹽。

 使用無機營養鹽的理由：

  1. They provide basic media to which organic compounds can be added according to requirements.以無機營養鹽為基肥，再視需求而添加有機營養鹽。

2.    Algae intermingled with bacteria, as they always are in nature, cannot generally be cultivated solutions containing organic substances, because the bacteria would multiply to such an extent that algae would be injured.以無機營養鹽培養細菌較不易大量增生而危害到藻類。

  1. For some algae organic compounds are not beneficial and may even be detrimental.對某些藻類而言有機營養鹽可能是有害的。
  2. Species growing in waters almost completely devoid of organic substances contrast in their nutritional requirements with those found in polluted waters. It is of interest to know how the respective groups behave in organic solutions.為了對照（比較）生長於完全無有機營養鹽及生活於環境被有機物質污染的藻類。
  1. .濃度及成份（組成）Concentration and composition﹕


最早培養藻類是以水耕法>失敗>因為太酸>更改pH值為鹼性>成功！！但無機營養鹽的特性少知（濃度、成份等）。此外營養鹽配方的精密及複雜性常會造成誤導。 對照各種營養鹽的配方可發現為達到目的，營養鹽的成份須有多樣性且量亦須精確地標示出來。
M大部份的藻類不會因培養鹽成份有些變化而大受影響，否則它們怎能在自然環境中生存下去。
M藻類本身改變所造成的影響比營養鹽的改變更具決定性。

 

（也就是說， 營養鹽的濃度及成份的小變化是不值得討論的。）
M關心氮、鈣、鐵、鈉及氯等的濃度已成為歷史，但也不可立即拋棄之。

儘量簡化營養鹽的配方，多做實驗在合理的狀況下養出藻類。
在特定需求下，不同濃度之營養鹽是必須的，因其可獲得最佳之生長。

B.氮之供應The nature of the nitrogen supply﹕
M藻類較不喜歡亞硝酸鹽(nitrites)，甚至亞硝酸鹽對藻類有毒，因此藻類大部份是利用硝酸鹽(nitrate)及氨鹽(ammonium salts)。

M具葉綠素的藻類能利用硝酸鹽及氨鹽，但沒有顏色的藻類只能利用氨鹽。

 由於藻類較喜歡利用氨鹽，故水中的氨鹽會逐漸減少，水的pH值下降->水變酸->不適合大部份的藻類生長。因此可利用(NH4)2HPO4及KNO3二者來配製氮鹽﹐其中KNO3較不會影響pH值故其使用濃度可以高於(NH4)2HPO4﹐因為(NH4)2HPO4中的NH4先被用掉，造成pH值下降。

在高等植物中的小麥，因為同時利用掉NH4及NO3所以pH能保持平衡。

其它化學元素Other chemical elements﹕
氯不必要，鈣的功能不確定，因許多藻類在沒有鈣的培養液中生長得很好。

磷可有效緩衝H離子（增加鹼度），但如果有大量的磷存在，則可能無法避免藻類的大量繁生。

雙碳酸鹽在自然界有緩衝的作用，但在實驗室中則無法利用。

醋酸鹽亦可利用來緩衝酸鹼度，但其容易被藻類代謝掉。

其它物理–化學實驗的緩衝液則可能有毒。
M藻類即使在六大必須元素K､Ca､Mg､Fe､S及P以適當的鹽類、濃度及pH值下，在接續下來的次代培養(subculture)中可能所有的藻類全死光，或者是只有有限度之成長。其可能原因是藻類須要其它非常低濃度的特定元素。(ex. Spirogyra在硬玻璃瓶培養->失敗。在普通玻璃瓶培養->成功。推測：普通玻璃瓶可提供鹼性鹽類及某些必須元素（鹽類）。
M特定的浮游藻類只能生存於配方較複雜的培養液中，其原因可能為〞緩衝〞之必要及各離子之平衡，另外必須元素的補充亦很重要。
M添加由有機物質而來之灰份(ashes of organic tissues)，代表所有的必須元素都有了。->用鹽酸將灰份溶解，再中和之，可獲得適當的培養液。

鐵､銅､鋅､錳､鉬､碘､矽等被認為是不可缺（必須）之元素，因為它們在高等植物及蕈類的養殖中，有效的影響其生長。

The fact the much more is known concerning nutrient solutions for higher plants shows that there is still a wide and promising field for investigation with respect to algae.然而在藻類尚有許多此方面的領域須探討。

3.   土壤､泥煤等之萃取物Extracts of soil, peat, etc.﹕

 Humus compounds, however, seemed to offer greater promise, since they occur in most natural habitats, though only in low concentration.

腐質酸化合物，雖然只以低濃度使用，因為其來自於藻類天然的棲息地﹐其似乎能有很大的提昇生長的功用。

The humus cannot be extracted with alkaline solutions, because, as a result of neutralization, colloidal humic acids are precipitated.不可用鹼性溶液來萃取，因中和作用會將其沈澱出來。 But, by treating soil with boiling water, a brown liquid is obtained which is effective. Any garden soil is suitable, but old leaf mold that has undergone decay for at least three years is best; if there has been less decay, the growth of many bacteria is encouraged. If possible the earth should contain no clay, the presence of which makes it difficult to obtain a clear solution. Acid soil can be neutralized by the addition of chalk before boiling.用煮的方法來萃取。以腐敗過之花園土壤較好。
M萃取方法：通常是水﹕土=2﹕1來萃取，在配培養液時再稀釋10至50倍。

土壤萃取液的功用可能為﹕1.buffer作用∼可避免Fe3的沈澱。2.含有某些必須元素。

土壤萃取液可以焦糖或鐵化物代替。

(因為土壤萃取液只含少量有機物質，因此下面將介紹如何來萃取有機物質。）

  1. 有機培養基Organic media﹕

A. Organic compounds.

將pure culture之藻種接種於有機培養基中，如果此pure culture有細菌污染則培養基上會有細菌大量增生現象，表示此pure culture真的受細菌污染。

 一些不具葉綠素之藻類，特別是腐生性藻類，明顯地有機物質是很重要的。
M理論上，許多化合物都必須先嚐試，如果有劇毒的就必須一開始就不使用，而具有趨化(chemotactic attraction)性質的化合物，當然較為有效。但能夠使藻類快速且大量增殖者，則只有少數幾種化合物被使用。其中可分為以下三大組：

 碳水化合物carbohydrates。

Dextrose(R) 0.2-5%

 有機酸鹽類salts of organic acids。

Acetates(R) 0.1-0.5%

 Peptone消化蛋白。

Peptones result from the enzymatic decomposition of proteins.
M培養基如果有其它的有機物存在，例如糖或醋酸鹽，peptone的濃度為0.02-0.2%，但如果光只用peptone則濃度稍高一點較好。調配peptone或其它有機物質的培養基較不會像配無機培養基時，有pH值變化的問題，但pH值仍然須注意。

B.   .植物及動物組織之萃取物Extracts of plant and animal tissues﹕

Extracts of seeds, especially when germinating, contain many valuable nutritive substances. During germination starch is transformed into dextrine（糊精）, maltose（麥芽糖） and dextrose（葡萄糖）, proteins into albumoses（膘） and amino-acids, all of which are soluble in water and can be extracted by boiling. Such seeds appear also to contain subsidiary substances, capable of promoting growth, which are still insufficiently know. 糊精﹕介於澱粉和麥芽糖間。膘﹕加熱不凝結的一種小分子蛋白質。

& Most usually malt（麥芽）is employed.F 濃度為0.2-3%

? beef extract:以Difco廠牌標準化的產品最好。F 濃度為0.05-0.5%

? yeast extract:可以一種yeast autolysate（自溶鹽）來調製：85g的麵包酵母及400mL的自來水，裝於瓶內其上覆蓋幾㎜的toluol（甲苯），攪動以後栓緊瓶蓋，置於30-40℃下培養幾天，要用時再以滴管吸取，但要避免吸到甲苯，微量的甲苯在滅菌時會揮發掉。

  1. 凝膠狀的培養基Gelatinous media：

Such gel-like media are used for plating, for maintaining cultures and for experimental purposes. The principal object attained by using these media is to fix cells at specified places so that they can be easily observed and can develop into genetically homogeneous populations. 用於劃線培養時、用於實驗需求時。主要地是利用此基質來將細胞固定於特定的地方，使其易於觀察並發育成遺傳上相同之族群。

Such gels must therefore be sufficiently solid to prevent mingling of the cells, be translucent admit of observation with the naked eye and with optical instruments, and must contain food substances to allow of multiplication.膠要足夠固化，避免其它細胞混入。透明度要高，可以被肉眼及光學顯微鏡觀察；此外尚須含有使藻類可以增殖的營養。

An appropriate medium is obtained by mixing aqueous solutions of gels and a suitable nutrient medium.

& gelatine﹕(8-10%)

Gelatine is no longer employed as much as in the early days of microbiology, buy it is still used for various purposes, especially to test organisms for the presence of proteolytic enzymes.用來測試微生物是否有蛋白水解𠕇，非常有用。

Fgelatine不能置於滅菌斧中，只能在蒸氣箱中蒸數天，然後在有熱水的漏斗中過濾，以便使其透明。比較現存的配方﹐此步驟還不算是太麻煩。

F 方法：

  1. The necessary amount of gelatine is soaked in 90% of the water. Gelatine溶於九份水中。
  2. the nutritive substances are dissolved in the remaining 10% of the water and, if necessary, the solution is filtered.營養鹽溶於一份水中。
  3. To obtained a clear a gel, a little dry egg albumen is shaken up with a small quantity of the water and the clear fluid poured into the nutritive solution.利用蛋白來吸附混濁物而使沈澱出來。
  4. The required number of test tubes, provided with cotton wool plugs, is prepared. These , as well as the flasks containing (1) and (2), are autoclaved for a minute or two. After the autoclave has cooled, the gelatine and nutritive solutions are mixed, and 6-7㏄poured into each of the sterile but still hot test tubes, contamination by touching the rims of the flasks and tubes being avoided.將(1)及(2)滅菌後，混合再注入滅菌過之試管內。

F試管置傾斜位置。
 
? agar﹕同樣地agar液和營養鹽液不可混在一起滅菌。（分別滅菌後再混合）。

F agar都會凝結，其好壞之分在於彈性的強度：不好的agar，在搖動時易破碎，在接種時容易被弄破，斜面易於倒塌，而使藻類不易生長。

F不要一次做太多，因為重覆溶解是有害的，重覆溶解的agar容易變乾。

F放albumen無助於透明度，但改放一片纖維紙可以使其變透明。

F 如果agar是呈黃黃的顏色表示加熱太久了。

F在酸性或腐敗法中易使agar的硬度變小，而影響其彈性。

F使用稀釋的agar液可避免藻類細胞太快沈到底部。

? silica﹕材料為矽酸鈉又稱水玻璃water-glass(Na2SiO3)
F在配製之前先將矽酸鈉以稀鹽酸洗一下，可使矽酸鈉的雜質（其它鹽類）及氧化的二氧化矽沈澱出來。
& 矽酸鈉所含的鹽會使medium的鹽濃度太高。
? 二氧化矽易使medium變硬。

F稀鹽酸的配法：

純HCl稀釋成1.1之比重後再加九倍的水稀釋。

F洗矽酸鈉時﹐矽酸鈉﹕稀鹽酸為1﹕1。

F 洗法：

  1. .水流洗24小時以上。
  2. .倒置，將水滴乾。
  3. .加入蒸餾水。
  4. .將蒸餾水置換成雙倍濃度（即一般濃度的2倍）的營養液，置放隔夜。
  5. .慢慢加熱（滅菌）以免產生氣泡。除非污染細菌的孢子，否則加熱一小時便足夠。

F Silica-gel plates are used for the culture of autotrophic organisms, which on agar would become overgrown by bacteria. They have proved useful in the preparation of pure cultures of Cyanophyceae and would no doubt be more widely empl9oyed, were it realized that their preparation is not especially difficult.最適合自營性藻類，因agar容易滋生細菌。以其培養藍綠藻最適配，此外並可廣泛用於其它品種，因其製備上不是特別的艱難。

  1. 不透明固體基質Opaque solid substrata：
  1. 潮濕的固體基質，例如泥土、樹皮等。用於繼代培養(subculture)有實際的效果。

F必須加熱消毒，否則細菌會overgrowth。但加熱會產生腐植酸，對藻類有害。
 
F砂、石膏、濾紙、纖維素、多孔的陶器及瓷器等構成之基質也可利用﹕放在玻璃瓶內，加培養液後滅菌之。

F 好處：

&多孔F creeping filamentous species可穿透。

? semi-moist半潮濕。

? 較像自然狀況。

Chapter IV 第四章

以平板培養法來做純培養Plating methods for making pure cultures

The aim of any plating method is threefold目的有三 :

  1. to immobilize single individuals, if possible individual cells, so that they do not become intermingled.固定單獨個體，避免其它品種混入。
  1. to separate them from other organisms which might interfere with their development.分離可能影響它們生長的其它生物。
  1. to provide them with nutriment and other conditions favorable for their multiplication into genetically homogeneous populations.提供營養及其它較適宜狀況，使其能大量生殖相同遺傳性的族群。（使一個藻類被分離，並使其後代仍維持單離狀態，且維持在一個特定的小區域中生長。）

F colonies:相同遺傳族群F starting-point for “pure culture”.

F Plating media平板培養法的基質必須：

& 充足的固化，以避免細胞互相混合。

? 能吸附營養物質及水份於基質中。

? 須半透明，以便於觀察及研究。

平板培養法可分為兩種，混合法及表面接種法：

  1. Mixing混合法:

Gelatine is no longer used for this purpose, because it is easily liquefied by micro-organisms and because many species fail to grow on it.

F 凝膠已不再使用﹐因為它容易被微生物液化並且有許多藻種無法在凝膠中生長。現均改用藻膠(agar)。

F方法：

攪動使細胞均均勻分散，加入滅菌水稀釋（連續稀釋至一定量的數目）? 一定量的細胞和液化（尚未固化）的agar相混合(at 40-50℃) ? 旋轉以使其均勻分佈? 固化。

F此方法的缺點：

& 不知何者會長出來。

? 某些品種不會在agar內生長，例如衣藻Chlamydomonas､素衣藻Polytoma不在agar內生長。

? 在agar內CO2可能缺乏。

? 在agar內的族群其生長較在表面上生長的慢，且外表形態不易辨識。

M在三角瓶內的mixing culture（agar及藻類族群），可能需數星期至數個月才可長到可分辨及轉殖的大小。

? 在三角瓶內的agar要打成碎片才能取出藻類，在打碎過程很容易造成細菌的污染。

? mixed方法必須重覆很多次才能達成pure culture.

  1. Surface inoculation表面接種法：

F For these various reasons（基於以上的理由）it is preferable to spread the algal cells over the surface of the agar after it has solidified.由於mixed法缺點太多，所以表面接種法較常用。
F 優點：在表面比在agar內﹐較易達到pure culture。

F 缺點：表面較易長出太多細菌。（如果藻類能夠以擴散的方式長出來，則可很容易將其挑出來。）

F 因較嬌弱的藻類只能在agar表面生長，而那些以mixed法能生長的藻類，通常為較有耐性的品種，通常其又較無研究的價值。

F 使用表面接種法須注意：

&agar要有充足的堅實度。

? 保護其不受污染。

F 使用培養皿(Petridish)的問題：

& 空氣中細菌孢子的污染。

? agar易變乾。

F因培養皿為培養藻類不可或缺之器具，故須以下列事項來改進：

& 培養皿的蓋子必須蓋緊。

? 必須事先滅菌。

? 環境要乾淨。

? 培養皿滅菌後要立即使用。

? 培養皿須放在乾淨的地方。

? 培養皿要使用時才能拿到實驗台上，且須立即使用。

? 蓋上蓋子後須用貼布貼緊。

F下列三項原則可使plating較易成功：

& 使用簡單無機營養鹽來配agar（細菌在無機營養鹽中較不易滋生）。

? 多練習可以減少細菌的污染。

? 加葡萄糖可加速藻類生長，但也加速菌絲的生長，並且加葡萄糖並不是均適合於所有藻類，故加泥煤或土壤(peat or soil)的萃取液較好（不可同時在滅菌斧中加熱）。

F 如果想利用一種使細菌不長或長得慢的培養基來養藻類，是不適當的，（適得其反）因為讓細菌長出來至肉眼可見，才能夠從細菌的colonies中挑出藻類來。? 選離細菌最遠的藻類的colonies最好。

F 三種方法可使藻類均勻分布於agar表面，但各有其優缺點：

& 噴霧法(spraying method) 其又稱為混合法(mixing method)﹕(see text pg.63 fig. 2: Spray diffuser)

F表層只能噴一層薄薄的，否則藻類細胞會混入agar內。

F使用的agar plate要較硬，這樣噴灑在其上的水，會較快乾掉。

F藻類細胞的濃度要相當濃，且不可有太多細菌的污染。

? 劃線法(streaking method)﹕C 用劃線法的好處在於不需大量的細胞來接種。其方法為：

由１處開始劃，在線末端交接處轉向，開始２處之劃線，同樣地在線末端交接處轉向開始３處之劃線。其中群落之密度由１向３漸小。因此由３處較易挑出單一藻種。

F可用玻璃棒或白金絲，也可用其它器具例如棉花棒等來劃線，視接種的藻類其大小及特性而定。

? 特殊法﹕利用藻類本身可以爬行的能力。

F最討厭的是，在這些會爬的品種中，有些不是我們要的品種F麻煩大了！

FCreeping movements are exhibited by Cyanophyceae（藍綠藻）, Desmids（鼓藻） and Diatoms（矽藻）, as well as by the amoeboid stages of Chrysophyceae（變形期的金藻類）and other organisms.

F不幸的，會爬行的藻類其外表通常會覆有一層由其所分泌的膠質，此膠質極易著生細菌。

F改善方法為要接種的藻類在接種前須先洗一下。

例如：將含於膠質(mucus)的矽藻培養於agar之上前﹐先以毛細滴管法(capillary pipette)清洗一下（註：下一章講毛細管法），可以避免在矽藻尚未大量生長前就有細菌及變形蟲大量長出來。
? 其中以噴霧法最好，但也較不易操作。

平板培養法及平板培養法，藻類細胞分佈較為均勻。

  1. Transference of bacteria-free cells to sterile media將無菌藻類細胞轉殖至無菌培養基之方法：

& A wire needle, to the tip of which water films or mucilage containing algal cells will adhere利用金屬線的尖端來沾取藻類細胞﹕

Most workers use a platinum of nickel-chromium wire to pick up algal cells for inoculation into new media.用白金或鉻鎳線來挑起藻類並接種到新的培養基。（在接種前金屬線須燒紅（滅菌））。

F缺點：藻類的colonies須分得很開。

? A small lancet（小手術刀） to cut out pieces of agar containing algal cells.將含有藻類的agar切成小碎片再轉殖至新培養基。（刀片亦須先燒紅）。

? A capillary pipette of very fine dimensions for sucking up liquid with algal cells利用極細小的毛細管來吸取藻類細胞﹕

The best instrument is generally a capillary pipette, like that used for lifting cells from a liquid medium. This can be employed also on an agar surface.毛細管是最好的工具，就如同由水中捉取藻類細胞般，也可以由agar的表面吸取藻類。

Chapter V 第五章

The pipetting or washing method毛細管法（或洗滌法）

F 無法在agar上生長的，豈不就無法獲致pure culture，因此發展出毛細滴管法。

F 器具：

&雙眼解剖顯微鏡，倍數在40-80倍。

? 少量無菌培養液（太多反而會找不到藻類細胞，但較大量之培養液可稀釋細菌的污染）。

? 在培養皿內放一錶玻璃做為培養室。

? 毛細滴管。

F 注意事項：

&不可用自來水洗，因為藻類細胞可能變成休眠細胞(rest cells)。

? 用培養此藻類的培養液來洗也不好，因為容易起泡沫。通常是以無機營養鹽類及土壤萃取液和適當的pH值較好。

? 如果能注意藻類的生態情形則較不會失敗。

? 如果只是用來作無菌培養（非單離細胞），則可多吸一些藻類細胞。在吸一個一個藻類細胞時，可以看到毛細管內的液體一上一下的，直到毛細作用停止為止。

… 有些藻類細胞具有趨光性，會向光源一直跑。因此可轉動錶玻璃180°使其向光線之方向跑，則較易吸取之（當細胞移動時即為吸取的好時機。

? 在接種時一次種兩個細胞較保險。

? 不能用毛細管的頂端去移動藻類細胞，必須用吸的。

失敗原因：

?滲透壓。

? 有害物質。

? pH值不適當。

? 氣體成份。

F 雖然有很多人認為較大的細胞才可能被單離(isolate)出來，但單離應不受細胞大小之限制，事實上鞭毛藻類通常只有10μm大小，反而較易被吸到。

F 不動的藻類細胞其限制可能較多，主要是它們較不易被辨認出來，藻類細胞太大反而須較強吸力才能被毛細管吸上來，以及要多洗幾次才能去除細菌。

F 有六大理由來繼續使用agar culture：

 

&可觀察典型藻類細胞之特徵、特定的形態及提供生態上之資料。

? 在agar上比液體內更容易觀察絲狀藻類。

? 可以直接在顯微鏡下觀察到藻類細胞的分裂、爬動甚至生殖行為。

? 可添加特別的物質於agar中；例如：牛奶、澱粉、糖或添加指示劑，這些對酵素研究過程有重大意義。

? Agar culture可以很方便地用來長久維持藻種。

? 藻類在agar上能維持健康﹐並且比在液體培養基更容易辨識出是否受污染。

 

Chapter VI 第六章

Brief resume of the modes of preparation of pure cultures

再確定預備純培養的模式﹕

F It will be useful to recapitulate briefly the whole process of preparing pure cultures, to facilitate selection from among the various possibilities.

The first point to be taken into consideration is whether the species concerned is one which is motile during the greater part of its life (i.e. is one of the flagellates), or develops flagella for short periods only or not at all, or alternatively whether it exhibits active creeping movements.藻種具活動能力是否為其一生中絕大部份或只有一小部份，甚至沒有，亦或是否有爬行能力，在預備純培養前是首先要考慮清楚的。

In the first case the pipetting method is the most useful, and may be indispensable if the species fails to grow on agar. With true algae zoospores should be used wherever obtainable and treated like flagellates, i. e. first washed and then plated. 首先，如果藻種無法在agar上生長，那麼毛細管法是不可或缺﹐且是最有用的方法。又如果藻種可以在agar上生長，則可結合pipetting及plating二者方法。即先以pipetting法洗藻類細胞後，再以plating法將藻類培養於agar上。Forms possessed of creeping movements are also washed and plated, but it is best not to distribute the cells uniformly, but to deposit them at definite places on the agar.會爬行的藻類在plate之前，可先用毛細管法洗過後，再將其接種在特定區域而不是將其均勻分散的接種。

F With most algae success is quickly achieved and with the least expenditure of labor by streaking the washed cells over an agar plate.將洗過的藻細胞用劃線法接種於agar上是最快能成功地，且最省力地養出大部份的藻類之方法。When the required species is contaminated with many other organisms, it is best to inoculate single cells into soil-and water cultures, the pH of which is adjusted to the prevailing in the original habitat. When sufficient multiplication has taken place, cells ate plated on to agar, either directly or, better, after renewed washing. Flagellate forms and zoospores ate washed carefully and repeatedly and can then be used to inoculate slopes or liquid media.如果藻種污染了許多其它生物（例如，細菌），則必須先將此種類接種於土壤–水之培養基中，其pH值要調整得和自然環境一樣，當藻類細胞數量足夠時，最好重新再洗過，然後才接種於agar上。鞭毛藻類則須用毛細管法重覆洗幾次再接種於斜坡agar上或液態培養基內。

單種(unialgal)的藻類先培養在土壤–水(soil-water culture)的培養基內之好處（先預養在細菌較無法生存的環境中）：

&可確保藻類之生長。

? 可在最佳狀況，不會和其它藻類相混淆下，做其品種鑑定以及形態和生殖上之研究。

? 可以有大量及健康的藻類作繼代培養(subculture)，因此可獲得各種種類之藻種。

? 可以有充足的時間去準備agar plate或其它的培養基，並且可在充分時間及較方便的狀況下去除細菌。即使藻種放在實驗室超過兩天，也不會失去具研究意義的藻種。

? plating對單種的藻類較有效，對混合品種則較無效。在純種化(purification)時有兩個階段：a.準備單種或純種培養b.完全無菌培養。

? 可以在顯微鏡下洗，雖然此時無法確定品種，但小於12μm的鞭毛藻亦可在洗過後而無細菌之污染。

? plating最主要的目的是去除細菌以外的其它生物，因為細菌很容易長滿agar表面而被分辨出來。如果有蕈類的菌絲、變形蟲、矽藻及藍綠藻長出來﹐則整個培養要放棄重來。

? 使用於將藻類弄乾淨為目的的agar plate之材料和時間均可以大量節省下來。

 

Chapter VII第七章

Treatment and utilization of cultures純種培養之藻類的處理及利用

  1. Illumination光照：

It has long been known that direct sunshine is harmful to algal cultures. Under natural conditions the full rays of the sun rarely fall on an alga and a few centimeters of interposed water are sufficient to reduce the harmful effects.光直接照射到藻類對藻類是有傷害的，但光經過幾公分的水的干涉即足夠去除此有害的效應。

F 人造光光波比太陽光長，故加熱效應強（被用來固定CO2較少，因此有較多光能轉成熱能），因此以人造光培養藻類須注意溫度之變化。

F 目前已有恆溫培養箱，可設定溫度及光照強度。

  1. The maintenance of culture純培養之保存（保種）﹕

F 由agar比由液態培養基而來的subculture來得較易準備，並且在agar上較易檢查是否受到污染。

F 如果保存良好﹐subculture一年可少於四次。

F 如果因為agar太乾或藻類太少而無法subculture時，可倒入一些無菌培養液於試管內，蓋滿agar slope，這樣子藻類便會開始生長。

F 至少保持三組不同年齡的藻種。

F 可藉由agar? liquid的方法不斷改變環境，來保種。

F 在agar培養（保種）太久的藻種不適合用來研究形態及生殖等特徵。

3.The use of cultures純種培養的用處：

1.morphological and cytological studies;形態及細胞學之研究。

2.studies of ontogenetic development;發生學之研究。

3.definition of species;品種之定義（分類）。

4.variability and mode of origin of species;品種之原始模式及其變異之研究。

5.cellular pathology;細胞病理學。

6.cellular physiology; 細胞生理學。

7.physiology of development;發育生理學。

8.physiology of nutrition; 營養生理學。

9.physiology of metabolism; 代謝生理學。

10.physiology of irritability, especially tactic movements;刺激（過敏）生理學，特別是趨向運動方面。

11.ecological studies;生態學之研究。

12.biological examination of water;水之生物性檢查。

13.as a food for animals under investigation.餌料生物之研究。

有一些因環境之影響，並且因遺傳上之不同，而有所變異的藻種，光以顯微鏡觀察是無法了解的。而藻類的純種培養，可以解決此一難題。


藻類比其它生物適合於做水族生態研究，因為水中生長之植物比陸生植物較容易控制（陸生植物尚須考慮溼度、氣溫、大氣壓等等，故較不易控制）。


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