青海菜之種子化
摘要 ：
本研究的目的是去分離及培養青海菜之原生質體，然後引誘其發育成絲狀體做為藻類種子化之用。本實驗是以4%的纖維酵素，2%的軟化酵素（Onozuka），來分離原生質體，並在50RPM的振盪培養下，於1.2M山梨醇溶液中6小時後，可獲最高的原生質體產率9x106個/每克鮮重藻體（葉狀體及固著器）。由葉狀体及固著器而來之原生質體體培養在PES培養液中，通常在6小時內開始再生細胞壁，並在6至9天內開始分裂，在14至18天內分化成細胞串、絲狀體或者是管狀體。在三月份所採集的青海菜其葉狀體之原生質體約有60%再生成管狀體，而約有45%的固著器的原生質體再生成絲狀體。然而，在五月份所採集的青海菜只有1%的原生質體直接再生成葉狀體，而另有59%原生質體再生成不具分化能力的細胞串。而由固著器而來之原生質體則無再生能力。這些由原生質體再生而來的絲狀體培養於66 mmol photons.m-2.s-1的光度24℃，超過了三年，當它們被移到光度166及300 mmol photons.m-2.s-1的光度及溫度18-30℃下，它們能夠再生成管狀體。最後，將這些管狀體培養於300 mmol photons.m-2.s-1的光度及溫度為18-22℃，它們發育成大型的葉狀體。因此，這些絲狀體可做為青海菜大量培養之種苗。
關鍵詞：藻類種子化，固著器，青海菜科，青海菜，原生質體。
二、前言
大部份重要的經濟藻類是由自然環境中採集而來的。這樣常造成這些藻類的族群大量的減少，由於這些藻類的再生能力很低，而無法來補充這些被採集的藻類。因此，發展養殖這些經濟藻類做為將來需求所用，這是非常重要。可是，海洋藻類沒有相當於陸上植物，具有抗性、耐性及可休眠的種子。並且除此之外，藻類具有相當複雜且會變換形態的的生活史。因此，發展一套運用‘種子化’的方法來養殖藻類，是非常重要且必須的(Polne-Fuller and
Gibor 1987)。根據以上的觀點，本研究使用一種重要的經濟大型海藻，青海菜(Monostroma latissimum Wittrock)，做為藻類‘種子化’的研究。
青海菜是一種分佈極廣的大型綠藻。他的葉片只有一個細胞的厚度。青海菜非常的美味，在日本已經被大量商業性的培養好幾年(Shokita et al.
1991)。在台灣青海菜是被做為食物的補充品的。但是，人們仍然在研究，如何發展商業性的養殖方法以培養這些藻類。青海菜的傳統養殖方法是非常繁瑣及耗時間的，有時常會很難去獲得足夠的成熟青海菜葉片，及足夠數目的配子或動孢子來接種於網繩上。因此，發展一套新的青海菜養殖方法是非常重要的。
藻類原生質體不像一般的藻類孢子受限於環境因素的影響，他可以很容易的經由培養而非常快速長成小種苗。這個新的方法，可能可以加速成功的培養出藻類。但是根據我們先前的報告，直接由原生質體再生而來的小種苗，如果沒有立刻直接的轉換到海邊去進行更快的大量培養它們將會死亡。因為，實驗室沒有辦法提供自然環境所能提供給它們大量的面積以及必須足夠的光度，以及新鮮的營養鹽。假如，這些由原生質體再生而來的小種苗，能夠像高等植物的種子般的播種，這樣子就比傳統的養殖方法來的方便許多了。這個意思就是說，我們能夠將藻類的‘種子’長久保存在實驗室中，當我們需要時再拿出來播種便可以。
本研究主要的目的，是要獲得可以長久保存且具有再生成大型葉狀體的藻類種苗，做為將來藻類大量繁殖之用。
三、材料及方法
青海菜藻體是於1994年三月及五月於澎湖講美採集。採上來的藻體立即以乾淨的溼布包裹，並以海水保持潮濕，置於密閉含有海水之塑膠保溫盒內，帶回基隆國立台灣海洋大學養殖系。
乾淨及無菌藻體之準備：
本方法是以Reddy et al.
(1989)方法，稍加改良而來的，其方法為：將藻體先以過濾海水沖洗，然後置於內含高溫滅菌過之海水及1%碘化鉀—碘的超音波洗滌器內（Branson 3200）沖洗三次每次三分鐘，以去除小動物及其他植物。然後，這些藻體先在高溫滅菌過之海水中浸泡幾次，最後置於100毫升且內含10毫升的混合抗生素（Polne-Fuller and
Gibor 1984）的PES (Provasoli
1968)培養液，於植物培養箱中（Firstek, Taiwan），66 mmol photons.m-2.s-1的光度，24℃下培養6小時。
細胞壁分解酵素的準備：
以4%的纖維酵素(Cellulase, Onozuka R-10)，2%的軟化酵素（Macerozyme R-10），1.2M的山梨醇(sorbitol)及酸鹼值設定為6.0的磷酸緩衝溶液(Na2HPO4-NaH2PO4)來配製10毫升的細胞壁分解酵素溶液。將這些酵素溶液置於離心機中以10000xg離心十分鐘以去除較大的顆粒。將上澄液以可丟棄式的0.2mm薄膜過濾器過濾滅菌之。
原生質體的分離：
將乾淨的藻體以滅菌海水沖洗三次後，將固著器由藻體上撕下，然後，在無菌操作台內分別以滅菌過之刀片將其切成0.5-1㎜2之碎片。各取一百毫克之藻類碎片於50x80-㎜可丟棄式培養瓶內（40-mL, falcon）內含十毫升的酵素溶液。將培養瓶置於橢圓旋轉器上（Firstek, Taiwan）旋轉速率為50RPM於黑暗中24℃下培養6小時(Chen and Chiang
1994)。
原生質體的純化：
經由以上的6小時培養後，以59mm的尼龍網將培養液過濾掉未被分解的藻類碎片。然後，將過濾液置於30%（w/v）的密度緩衝溶液（Ficoll-400）上，於100xg離心速率下，離心30分鐘（HERMLE Z320）（Chen and Chen
1991），以去除較小的碎片。原生質體是用巴斯德試管由中間界面層中回收。原生質體的產率是利用血球計數器（Brigh-Line,
improved Neubauer 0.1mm deep）於顯微鏡下（Zeiss, Axioskop）計數獲得之。
原生質體細胞壁之再生：
一種螢光染劑（Calcofluor white
ST, Sigma）被用來研究培養中的原生質體細胞壁再生的情形（Galbraith 1981,
Roberts et al. 1982, Chen and Chen 1993）。原生質體經由螢光染劑染色後，有再生細胞壁者呈現綠色，而沒有再生者為紅色。將約0.01%的螢光染劑添加於含有剛分離的原生質體及0.85M甘露糖醇之PES培養液的培養瓶中，並以配備有螢光設備之倒立顯微鏡（Zeiss, Axiovert 135, Excite
filter: Lp510-Kp560; Chromatic beam splitters: Ft580; Barrier filter Lp590），每小時觀察一次，以決定原生質體是否再生細胞壁。
原生質體的培養：
剛純化的原生質體是培養在含有0.85M甘露糖醇的培養瓶內（Chen and Chen 1991, Chen and Chiang 1994），將18個培養瓶分別培養於66、166及300 mmol photons.m-2.s-1的3個光度，及18、20、22、24、26、及30℃等6個溫度下（3x6=18），於12：12 L：D的光週期下。這些培養的原生質體於0.85M的甘露糖醇下培養5天後，直接轉移至不含甘露糖醇之PES培養液中，繼續培養（Chen and Chiang
1994）。培養過程中以附有照相設備的（MC 80DX）倒立顯微鏡（Zeiss, Axiovert 135）加以觀察及拍照其再生及分化的狀況。
絲狀體的培養：
將由原生質體再生而來的絲狀體移至內含500毫升的有棉花塞的三角燒瓶內，於光週期為，12:12 L:D，光度為66，溫度24℃的植物培養箱中培養（Firstek, Taiwan）。為促使其發育成葉狀體，另將絲狀體移至166及300 mmol photons.m-2.s-1的光度下，配和18、20、22，24、26及30℃的溫度下培養。
葉狀體之培養：
當大部份的葉狀體長到約0.5-1 mm長度時，將其由三角燒瓶中移到底部置有細尼龍繩（直徑為1mm），並含有12公升PES培養液的40x30x20公分的玻璃缸內，在光週期為12:12 L:D光度為300 mmol photons.m-2.s-1，溫度為22℃下培養。以立體解剖顯微鏡（Zeiss, SV-11）附照像設備（MC 80DX）及以照相機（Contax 167MT）附有放大鏡頭（Zeiss Makro-Planar lens, 60 mm）來觀察生長情形及拍照。
四、結果
以4%的纖維酵素及2%的軟化酵素並在1.2M山梨醇，於50RPM的橢圓振盪培養器，培養6小時下，可獲得最高的產率9x106原生質體（圖一）每克新鮮藻重（葉狀體及固著器）。
剛分離的原生質體在培養5小時內，開始再生新的細胞壁。雖然，每個原生質體的細胞壁再生情形不是很一致，然而，通常原生質體群細胞壁再生的比率隨培養時間的增加而增加。約在培養4-5天後，整個原生質體群中有85%原生質體再生出完整的細胞壁。
已再生細胞壁的原生質體，約在培養於PES培養液中6-9天中細胞開始分裂。由葉狀體而來的原生質體在培養14-18天後，發育成細胞串（cell clusters），而由固著器而來的原生質體則再生成絲狀體。
在三月及五月份所採集的青海菜的營養細胞（葉狀體不含固著器）所分離的原生質體，大約有60%具有再生能力，但是，因採集的時間不同，其再生分化的形式亦有所不同。在培養18天後，三月份採集的材料其原生質體直接分化成由固著器上長出，由幾列細胞所構成的，且其頂端成漸尖的管狀體（圖二）。然而，在五月份所採集的材料只有1%的原生質體再生成管狀體，而其它59%的原生質體則再生成不具分化能力的細胞串（圖三）。
相對於由營養細胞而來的原生質體，在三月份所採集的固著器大約有45%的原生質體，在培養18天以後，再生成絲狀體（圖四及圖五）。絲狀體剛開始是呈短及疏鬆分散狀，並由一串細胞所構成的，它的直徑約在15-25 mm。在五月份所採集的，由固著器而來的原生質體，則無法分化成任何型式的藻體，且最後這些原生質體完全消失掉。
如表一所示：不同的光照情形，會影響由固著器而來的原生質體再生成絲狀體的情形。當絲狀體培養在66 mmol photons.m-2.s-1的光度及18-30℃下，它們會長成粗及細的絲狀體（圖五），且不會發育成任何其他的型態。絲狀體剛培養時是成粗狀的（圖四），當培養超過一年，且沒有更換新鮮的培養液時，這些粗絲狀體變成細的絲狀體（圖五及圖六）。細絲狀體的細胞大小為4-8 mm的寬度，20-25 mm的長度，且比粗絲狀體細胞含較少的細胞質。細絲狀體的某些細胞（圖六）因釋放單孢子（monospores）而變成空的細胞。然而，除了這些空細胞外，在添加新的PES培養液以後，細絲狀體會恢復成粗絲狀體。此外，這些由細絲狀體所釋放的單孢子培養在66 mmol photons.m-2.s-1的光度及18-30℃下則會萌發成絲狀體。
相對於這些在低光照下培養，絲狀體培養於166 mmol photons.m-2.s-1的光度及18-30℃下，在培養的20至45天中，直立的管狀體（圖七；表一）由這些糾纏成叢狀的絲狀體上長出來。
在光度166 mmol photons.m-2.s-1下，溫度也會影響絲狀體發育成管狀體的數目，如同圖八所示，當溫度由18昇至30℃時，由絲狀體長成管狀體的平均數目由31.2上昇到115.4顆/每平方厘米，但是管狀體的長度卻隨著溫度之上昇而下降，其由平均73降至6厘米長度（圖九）。
在溫度超過24℃下，管狀體不會長成葉狀體。當管狀體培養在24至30℃，且光度為166及300 mmol photons.m-2.s-1時，它們的長度不斷的增長而成為長長的管狀體。
如同表一及圖十所示，光度由166增至300 mmol photons.m-2.s-1，且溫度為18至22℃時，可促使長的管狀體，在培養45天後，形成初始狀的葉狀體（initial leafy
thallus）。初始狀的葉狀體在這種狀況下，繼續培養至90天後，最後形成由幾片葉片所構成的完整葉狀體（圖十一）。
在本研究中，這些已被保存超過三年的絲狀體，仍然維持能夠再生成葉狀體的能力。
五、討論
青海菜原生質體的產率和Fujita and Migita（1985）的產率不同。這些不同的原生質體產率，可能是在分離原生質體時，採用不同的酵素成份及不同的滲透壓濃度、酸鹼值或藻體的生理狀況及生長階段不同所造成的。然而，本實驗的產率和先前同樣的藻種的結果是一致的（Chen and Chen
1991, 1993, Chen and Chiang 1994）。
在接下來的養殖過程中，原生質體的純化是一個必須的步驟。因為，只用尼龍網過濾的方法（Saga 1984），常會造成許多污染。本實驗使用高滲、高密度的一種密度緩衝溶液（density buffer, Ficoll-400,
Sigma），可以獲得最有效的、乾淨的原生質體（Chen and Chen
1991, Chen and Chiang 1994）。
本實驗的原生質體的細胞壁再生率為85%，高於Fujita and Migita（1985）的研究結果中的68.3%。這種細胞壁再生率的不一樣，可能是基因於環境的壓力，例如，滲透壓及溫度，它們會影響到原生質體的生理活性。
原生質體培養在0.85M甘露糖醇-PES培養液中，少於五天後直接轉換到一般的海水中培養，在這種低滲環境下，它們的細胞壁尚未再生完全，它們會喪失活性或死亡。另外來說，原生質體如果培養在0.85M的甘露糖醇-PES的培養液中超過5天，也會減低它們的再生率。這可能指示出，長時期的在高濃度的甘露糖醇溶液培養下，對原生質體是有毒的(Chen and Chen
1991, Chen and Chiang 1994)。Reddy et al.
(1989)及Reddy and Fujita
(1991)也有相同的報告指出，原生質體長時間的培養在高滲環境下的0.2-0.8M濃度的甘露糖醇-海水溶液中，會損害到正常細胞的分裂，而造成細胞有不正常的結構。
基於以上的原因，本研究採用我們先前實驗的方法（Chen and Chen
1994），也就是，原生質體先培養於0.85M甘露糖醇-PES培養液5天，然後，再直接轉移至不加甘露糖醇的一般加富營養的培養液（PES）中繼續培養。這方法可獲致具有高再生能力的原生質體（Chen and Chen 1994）。
在五月份所採集的藻類，包括一般葉狀體及固著器，分別只再生成細胞串（cell clusters）或死亡，而不能分化成其他的藻體。然而，在三月份所採集的葉狀體及固著器，分別能再生成管狀體（圖二）及絲狀體（圖四及圖五），而二者在高光度（300 mmol photons.m-2.s-1）及低溫下（18-22℃）皆能發育成葉狀體（圖十及圖十一）。相對於本研究，Saga及Kudo（1989）由另一種青海菜（M. angicava），分離的原生質體不具分化能力。Fugita及Migita（1985）則報告M. nitidum原生質體先再生細胞壁，然後發育成配子。這種在青海菜屬中原生質體不同的生長型式，可能基因於，原生質體由原來藻體所被分離的位置不同而不同。另外，不同的培養狀況下，例如：光度及溫度等，也會有不同的生長情形。以上的生長狀況在Polne-Fuller et
al. （1986）的紫菜原生質體的報告中亦有類似的結果。
在三月份及五月份，所採集的青海菜所分離的原生質體，其分化情形各有不同。這可能是因為藻類年齡的不同所造成的（Galun 1981,
Polne-Fuller et al. 1986）。一般來說，在澎湖青海菜在三月份生長得很旺盛，而到了五月份它們的族群就開始消退。換句話說，三月份的青海菜是屬於年輕的狀態，而到了五月份它們則呈衰老的情形。因此，雖然原生質體是由相同的品種的藻類來，他們的生理狀況各有不同，而造成他們的分化情形就有所不同。
到目前為止，尚無其他的報告指出青海菜在自然狀況下會形成游離的絲狀體。然而，以顯微鏡觀察一般青海菜的固著器，可發現它是由多列的絲狀細胞所構成的。因此，由固著器而來的原生質體確實會再生成游離的絲狀體。而光度及溫度可用來控制這些絲狀體的分化及去分化的行為。因此，絲狀體用來大量養殖是極具潛能的、有價值的一種可儲存形式的藻種。
本研究首先發表，由大型綠藻原生質體產生絲狀體的報告，在本文撰寫的期間，這些絲狀體已被保存且存活了三年以上。
簡要的來說，影響原生質體再生及分化能力的因素有﹕藻種的年齡及光度和溫度間的調配。本研究發現不管溫度如何，在不同的光度下可刺激其絲狀體發育成管狀體。但是，只有在高光度及低溫度下才能引誘管狀體發育成葉狀體。
六、結論
本研究成功的培養原生質體形成葉狀體。只有在低光度下，固著器的原生質體分化成絲狀體。這些絲狀體可當成種子般來使用，因其在養殖中會粘附在基質上並且成長良好。當絲狀體粘附在尼龍繩上，它們先發育出牢固的固著器，並由此有小的管狀體不斷的長出來。如圖十二在接種30天後，尼龍繩上蓋滿了管狀體，其密度約為每公分有25株藻體，而這些管狀體即可移到海邊做為大量養殖之用。此新的技術應可使這種美味且具經濟價值的大型綠藻更易於大量養殖。
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edition prepared by Yamachi M)
Table 1: Effect of irradiance and temperature on the differentiation pattern of isolated protoplasts of Monostroma latissimum Wittrock. Isolated protoplasts of holdfasts collected in March were cultivated in PES medium, with a photoperiod of 12: 12 L:D. They developed to form a varied pattern of algal bodies, such as filament (F), tubular thallus (TT) and leafy thallus (LT).
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Irradiance (mmol photons.m-2.s-1) |
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Temperature (°C) |
66 |
166 |
300 |
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18 |
F |
F & TT |
TT,
LT & F
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20 |
F |
F & TT |
TT, LT & F |
|
22 |
F |
F & TT |
TT, LT & F |
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24 |
F |
F & TT |
F & TT |
|
26 |
F |
F & TT |
F & TT |
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28 |
F |
F & TT |
F & TT |
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30 |
F |
F & TT |
F & TT |
圖解
圖一：剛分離之青海菜原生質體。
圖二：原生質體培養18天後，發育出管狀體（T）。原生質體是由三月份所採集的藻體所分離而來。培養環境為：166 µmol photons.m-2.s-1 photon flux
density and a photoperiod of 12:12 L:D at 24° C in PES medium (H: holdfasts area)。
圖三：由五月份所採集的藻體，所分離的原生質體，在培養18天後，再生成的細胞串（cc）。培養環境為：166 µmol photons.m-2.s-1 photon flux
density and a photoperiod of 12:12 L:D at 24° C in PES medium。
圖四：18天大之初始粗絲狀體（IK）及細絲狀體（IN），它們是由三月份所採集的藻體上的固著器所分離之原生質體再生而來。培養環境為：66 mmol photons.m-2.s-1 photon flux density and a photoperiod of 12:12 L:D at 24° C in PES medium. (P: protoplast from holdfast).