植物生物技術------原生質體的製備
編譯：石秀娟1 審稿：陳衍昌2
1海洋大學養殖研究所研究生
2海洋大學養殖系副教授
前言：
本文章是讓學生利用酵素去除植物細胞的細胞壁，然後觀察此圓球形的原生質體（即植物細胞去除細胞壁），學生可看到去除細胞壁後，植物的細胞的確有細胞膜存在。
另外，本文亦介紹''細胞的基因轉殖''的概念。也就是，將外來的DNA插入細胞內。已被轉殖的細胞有細菌、酵母菌、動物細胞以及植物細胞。不論轉殖任何形式的細胞，細胞膜以及細胞壁或兩者其中之一，必定要被穿透，然而卻不能破壞到細胞。因此各種的技術被發展用來轉殖不同形式的細胞，且大部份這些技術的機制，仍不是完全被了解的。一些植物可藉由Agrobacterium tumefaciens做為載體來轉殖。然而，並非所有植物都能如此做，因此直接將DNA轉殖是另一個方法。
以植物為例來說，在將DNA直接穿透細胞膜之前，首先決定性的步驟是先要移除其細胞壁。因此當分子生物學家準備要被轉殖的各種形式植物，尤其是茄屬植物（Solanacea）時，會先分離其原生質體。原生質體產生後，便可使用電破法（electroporation）或PEG法（polyethylene glycol）將DNA穿透進入細胞膜。至於DNA的微注射法（microinjection）則較少用。原生質體也可以用來做''原生質體融合''以產生混種（hybride），但很少成功。來自不同種間，分別處理過的原生質體，可融合在一起，而可應用在細胞的雜交。【註：目前藻類的混種十分地成功】
下列簡單的實驗是讓學生製備原生質體以便觀察，然而原生質體也可用來做真正的轉殖或癒合組織的誘導及組織誘導的計劃。但這些計劃的步驟不包括在這篇文章中。
學習對象：
植物生物學的介紹（高中生以上的學生）
需要花費的時間：
兩天，每天30分鐘（作為原生質體的製備和觀察用）。額外的活動、討論、應用則將需要花更多的時間。
消耗性材料：
設備：
化學藥品：
老師對於材料前準備的指導：
準備時間：一小時
緩衝溶液的配製(0.625M的mannitol，500ml)
【註：藻類則為0.84M】
1.先在200ml的蒸餾水加入56.94g的mannitol，使其溶解後，再加蒸餾水直到總體積為500ml。
2.每一組先取10ml 的溶液到試管或燒杯中，或在實驗期間提供每一組學生取10ml的總量。
Notes：
1.甘露醣醇（mannitol）是一種六碳醣類之醣醇，幫助維持原生質體的等張滲透壓（isotonic），其百分比濃度約為12~14﹪。
2.以上所配製的mannitol溶液其pH值約為4~5，若將mannitol的pH值調為6~7時，將可獲得更多的原生質體。（一滴0.1N的NaOH應足夠調整50ml溶液的pH值）。
3.0.625M的蔗糖溶液可和煙草葉作用的很好，也可和Elodea及波菜葉作用。但蔗糖會被細胞代謝，所以在培養期間，其濃度會降低，而影響滲透壓緩衝的能力。
4.若製備原生質體的目的，是要來做電破法或其他的轉殖技術的，則用0.6M的mannitol，25mM的MES緩衝溶液。也就是加54.66g的mannitol和2.44g的MES 到200ml的蒸餾水中，用1.0N的NaOH（約每50ml，15滴）調整pH值到5.7，然後加水至500ml，滅菌。
5.MES是一種酸鹼緩衝物質（用來維持蛋白質活性）。
酵素：軟化酵素（macerase）和纖維酵素（cellulysin）
Note：
1.在用之前，立刻將酵素加入緩衝溶液中，因這些酵素長時間在高溫下會不穩定。如果是在無菌台中操作下，可先用一個注射針筒，裝新鮮配好的酵素，用0.45μ的薄膜過濾消毒之。
2.Macerase (軟化酵素)是Sigma公司的專有名稱，也就是粗果膠酵素(crude pectinase)，是Rhizopus真菌萃取而來的。果膠酵素可將細胞與細胞之間軟化而分開。
3.Cellulysin是Sigma公司的專有名稱，也就是纖維酵素（cellulase），是從Trichoderma uride 分離而來的，此種酵素可溶解細胞壁的纖維素。
老師對於實驗大綱的陳述：（略）
下列的大綱將用轉殖的問題來當做活動的內容。
1.介紹轉殖的概念（外來DNA進入細胞的介紹）。討論為什麼人要轉殖細胞的理由。（引入新的基因，而使新的性狀進入細胞或生物體內）。
2.要求學生描述細胞的屏障（如細胞膜、細胞壁）。討論藉由這些屏障而能維持在細胞內的物質（如水、溶質、胞器、DNA）和思考如果這些物質沒有在細胞內，細胞的命運將如何。討論為什麼細胞可維持DNA在細胞內（膜可維持DNA在內，將可能同樣地會不讓DNA進入；假如病毒的DNA或RNA進入細胞內，通常會破壞細胞）。
3.引導學生思考出不傷害細胞的轉殖方法。並請學生詳述每個步驟的證明方法。
4.由學生來製備原生質體，並回答分析問題。
5.學生複習他們所提出的轉殖方法，並討論決定何者會成功。
外加的資訊：
關於原生質體
a.嘗試去決定原生質體可能的直徑（diameter）範圍。
b.嘗試去決定原生質體內的滲透壓濃度。
c.比較在相同的滲透壓溶液下，原生質體和植物細胞的不同。
為什麼這實驗要提出植物可容忍不同滲透壓和其脫水的能力？請比較植物和動物之間容忍各種滲透壓和脫水的情形。比較陸生植物或水生植物和動物間細胞內水分調節的不同適應情形。
接下來是原生質體的滅菌工作：全部的步驟都要用滅菌的設備。關於滅菌的設備及葉片的表面滅菌指導可看surface sterilization of biological materials。接著下面的步驟。
1.用滅菌過的棉布【註：尼龍網較好用】，過濾原生質體及葉片的懸浮液至50ml圓錐形離心管。先用5~10ml滅菌過的mannitol（不加酵素），潤濕培養盤，並同樣地潤濕棉布過濾器。然後過濾原生質體到離心管。
2.小心地離心（75Xg，2min），用滅菌過的pipette吸取原生質體懸浮液。
比較四個界之間的細胞壁（全部的細胞都有細胞膜）：
動物：無細胞壁；細菌：細胞壁有連結性的蛋白質和多醣類；酵母菌（菌類）：為具多醣類及幾丁質的細胞壁；植物：具纖維素的細胞壁（多醣類）包埋在其他多醣類和蛋白質的基質中。細胞壁的厚度隨著植物細胞的年齡和不同組織而不同。
預防措施：
1.假如你只要觀察原生質體，那麼精細的滅菌設備是不需要的，這個步驟可以不必使用酒精。
2.利用原生質體做轉殖的準備，則需要無菌設備的使用。即需要酒精和火的使用。
3.酒精是易燃的，要小心地使用。
學生的部份：
原生質體（沒有細胞壁的細胞）的製造
第一天---準備
1.洗手。菠菜（spinach）、喇叭花（petunia）、煙草（tobacco）或大型綠藻（Green Macroalgae）的葉子，放在水龍頭下將葉子潤濕，並拍乾。輕輕用鑷子或針刮葉子的下面。然後，切葉子約一公分平方的大小，並放入培養皿。取得足夠的葉片組織來覆蓋培養皿表面。（大型綠藻則用乾淨海水沖洗）
2.取10ml 的緩衝溶液到15ml的試管或小燒杯，加入先前量好的酵素粉末
3.到溶液內。攪拌或蓋住離心管前後搖晃直到酵素完全溶解。
4.小心地注入10ml的酵素液到培養皿的底部。
5.用鑷子將懸浮在酵素液的葉子壓下使其和溶液接觸，葉子可能會稍微重疊。
6.用parafilm或膠帶封培養皿並放置在室溫（約25℃）一天。若有足夠的設
備，輕微地攪拌培養皿將是有幫助的。
7.確定事先已準備一盤的葉子在不含酵素的緩衝溶液內。
第二天---觀察
8.輕微地攪拌並搖晃在培養皿的溶液（如果在顯微鏡內沒有觀察到原生質
體，則在間隔15~30min再觀察一次）。
9.準備一個未處理過葉子的玻片，並觀察其細胞的表面。
10.觀察原生質體：
a.拿掉parafilm和蓋子，置培養皿於解剖顯微鏡約50 X【註：亦可直接用倒立顯微鏡觀察】下觀察或
b.用一個大孔徑的吸量管輕輕地吸取一些綠色的溶液並放置在顯微鏡玻片上。用蓋玻片覆蓋，以低倍光學顯微鏡下瀏覽之。
1.描繪浸在不含酵素的緩衝溶液中的葉片細胞，標示所有觀察的部份並描繪細胞的外形。注意放大的倍率。
2.描繪含有酵素的溶液中的幾顆原生質體，並形容它們的表面（注意放大的倍率）。
3.在什麼情形下原生質體和未處理的植物細胞不同？
4.原生質體和動物細胞的比較如何？
5.準備一個玻片，放一片在含有酵素溶液的葉片，描繪並形容其邊緣。（注意放大的倍率）
6.基於你對原生質體和葉片的觀察以及植物細胞構成的知識，假設有關在酵素溶液內酵素的作用。
6.為什麼需要刮取並切葉片成小片？
7.為什麼要溫和小心地對待原生質體？
8.DNA可被加在經特別處理過的細胞溶液中，在這樣的情況下細胞將會吸取（uptake）DNA。DNA轉殖的技術已常被用在細菌和酵母菌細胞之間。且不需製造原生質體。為什麼茄科在轉殖前必須先製備原生質體。
參考資料：
Kyker,K.,1993.Protoplast Production（on web site）